一組耐多藥結(jié)核病診斷標(biāo)志物及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組耐多藥結(jié)核病診斷標(biāo)志物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，Mtb)是引起結(jié)核病的病原菌，以侵 犯肺部引起肺結(jié)核為最多見，也可侵犯肺外其他組織引起全身多器官多部位結(jié)核。由于治 療不當(dāng)?shù)仍?，越來越多的結(jié)核分枝桿菌對主流抗結(jié)核藥物產(chǎn)生了耐藥性，尤其是耐多藥 及廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)和傳播已成為全球結(jié)核病疫情回升的主要原因之一，是當(dāng) 前世界結(jié)核病診療中的難題，給全球結(jié)核病防治工作帶來了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。耐多藥結(jié)核病 (multidrug-resistant tuberculosis，MDR_TB，即結(jié)核分枝桿菌至少對利福平和異煙餅同 時耐藥）的出現(xiàn)和傳播，增加了結(jié)核病治療的難度，所用的二線抗結(jié)核藥物不僅毒副作用 大，費用昂貴，而且療效遠(yuǎn)不如藥物敏感的肺結(jié)核，成為當(dāng)前世界結(jié)核病治療中的一大難 題。更為嚴(yán)峻的是，廣泛耐藥結(jié)核病（extensively drug resistant tuberculosis，XDR-TB，即結(jié)核分枝桿菌在對利福平和異煙肼同時耐藥基礎(chǔ)上，也對氟喹喏酮類藥物中任何一 種藥物耐藥，以及對3種二線抗結(jié)核注射藥物硫酸卷曲霉素、卡那霉素和阿米卡星中至少1 種具有耐藥性的結(jié)核?。┮亚娜怀霈F(xiàn)并正在持續(xù)擴散，目前該病幾乎無藥可治。因此，在結(jié) 核病疫情控制面臨耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病嚴(yán)峻挑戰(zhàn)的今天，臨床上急需高效、價 廉、易于推廣的一種新的診斷耐藥結(jié)核病的方法已迫在眉睫。目前關(guān)于用血清學(xué)技術(shù)診斷 耐多藥結(jié)核病尚未見報道。
[0003] 目前診斷耐多藥/廣泛耐藥結(jié)核病常用主要依靠細(xì)菌學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測有 無耐藥相關(guān)基因的突變：1、傳統(tǒng)培養(yǎng)法:操作繁瑣且耗時長，從臨床標(biāo)本分離出結(jié)核分枝桿 菌的時間通常2 6周，不利于疾病的早發(fā)現(xiàn)及診斷；2、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)想多態(tài)性分 析法(PCR-SSCP法）：其影響因素較多(DNA片段長度、凝膠濃度等），可重復(fù)性較差，在臨床工 作中未得到廣泛應(yīng)用；3、RT-PCR法:對檢測條件要求高，限制其推廣;4、寡核苷酸探針雜交 法:是檢測結(jié)核分枝桿菌的一種快速方法，但存在一定假陰性率和假陽性率，且試劑價格相 對昂貴，未得到臨床推廣;5、基因芯片法:具有時限短、所需樣本少、熱循環(huán)和冷卻效率高等 優(yōu)點，但因分析軟件要求高，芯片的制作成本高等缺點限制其應(yīng)用；6、GeneXp ert MTB/RIF 對肺結(jié)核痰涂陰病人及耐利福平結(jié)核菌的檢測可以在2小時內(nèi)完成，為肺結(jié)核快速診斷提 供便利，但在經(jīng)濟欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)，應(yīng)用仍受限制。
[0004]總之，現(xiàn)有技術(shù)達(dá)不到快速、有效、價廉、便捷地診斷耐多藥結(jié)核病。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述技術(shù)存在的缺陷，提供一組耐多藥結(jié)核病診斷標(biāo)志物 及其用途，該組結(jié)核病診斷標(biāo)志物來自結(jié)核分枝桿菌的8個抗原，判斷被檢人是否為耐多藥 結(jié)核病，檢測結(jié)果表明，本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)組合診斷耐多藥結(jié)核病的最佳工作點的特異 性為80.4%，敏感性為80%，均高于現(xiàn)有技術(shù)中耐藥結(jié)核病診斷的指標(biāo)，且本技術(shù)為血清學(xué) 檢測，標(biāo)本容易獲取，適用于各種可疑耐多藥結(jié)核病，包括耐多藥肺結(jié)核和肺外結(jié)核病的診 斷。
[0006] 其具體技術(shù)方案為：
[0007] 一組耐多藥結(jié)核病診斷標(biāo)志物，包括抗Rv0363cIgM抗體、抗Rv2396IgM抗體、抗 RvllOOIgM 抗體、抗 Rv3509cIgM 抗體、抗 Rv3653IgM 抗體、抗 Rv0350IgG 抗體、抗 Rv0865IgG 抗 體和抗Rv2031 cIgG抗體，其序列對應(yīng)SEQ: ID: NO: 1 -SEQ: ID: N0:8。
[0008] 本發(fā)明所述耐多藥結(jié)核病診斷標(biāo)志物在篩選耐多藥結(jié)核病診斷產(chǎn)品中的用途。
[0009] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0010]本發(fā)明通過商品化MtbProtTM結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組芯片篩選耐多藥結(jié)核病診斷 分子標(biāo)志物，該芯片涵蓋>95%的編碼基因，包含4262個結(jié)核分枝桿菌重組蛋白。臨床血清 樣本包括正常對照組、活動性肺結(jié)核組以及耐多藥結(jié)核病組，分別獨立地與芯片反應(yīng)，以檢 測實驗組中針對某一種或幾種抗原蛋白，具有普遍性的特異性的抗結(jié)核抗體（IgG或IgM)。 基于初篩結(jié)果，選擇差異較為明顯的94個結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)及本研究團(tuán)隊既通過雙向凝 膠電泳技術(shù)分離獲得的6個結(jié)核分枝桿菌差異表達(dá)蛋白質(zhì)，自制含100個差異表達(dá)蛋白質(zhì)小 芯片，送公司點片，每個蛋白重復(fù)兩點點制，進(jìn)行200余份血清樣本的臨床驗證，最終獲得8 個診斷耐多藥結(jié)核病的候選標(biāo)志物（Rv0363cIgM，Rv2396IgM，Rvl100 IgM，Rv3509cIgM， Rv3653IgM，Rv0350IgG，Rv0865IgG和Rv2031cIgG)。聯(lián)合分析這8個蛋白質(zhì)相應(yīng)抗體的檢測 結(jié)果，判斷被檢人是否為耐多藥結(jié)核病，結(jié)果表明，本發(fā)明提供小芯片輔助診斷耐多藥結(jié)核 病的最佳工作點的特異性為特異性80.4%，靈敏度80%，均高于現(xiàn)有技術(shù)中耐多藥結(jié)核病 診斷的指標(biāo)。
【附圖說明】
[0011]圖1為基于MtbProtTM蛋白質(zhì)芯片的結(jié)核病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與篩選流程示意圖。
【具體實施方式】
[0012]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)地說明。
[0013] 一、血清診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與驗證
[0014 ]( - )基于MtbPr 01TM蛋白質(zhì)芯片的結(jié)核病診斷標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)與篩選：
[0015] 1.檢測原理:購買博柳生物公司MtbProtTM結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)組芯片，該芯片包 含4262個結(jié)核分枝桿菌重組蛋白，涵蓋>95%的編碼基因。臨床血清樣本包括正常對照組、 活動性結(jié)核病藥物敏感組，以及活動性結(jié)核病耐多藥組，分別獨立地與芯片反應(yīng)，以檢測實 驗組中針對某一種或幾種抗原蛋白，具有普遍性的特異性的抗結(jié)核抗體（IgG或IgM)，這些 抗原蛋白可以作為診斷標(biāo)志物來表征疾病狀態(tài)。
[0016] 2.實驗操作人：由芯片服務(wù)組生產(chǎn)人員執(zhí)行操作。
[0017] 3.流程圖如圖1所示。
[0018] 4.實驗操作步驟：
[0019] 1)預(yù)封閉：使用芯片孵育盒(廣州柳博公司自制），加入5ml封閉液，將待質(zhì)控芯片 從-80°C取出，正面朝上置于孵育盒中；再橫向放在側(cè)擺搖床（國產(chǎn)）上，50-60rpm，室溫， 10min〇
[0020] 2)封閉：倒棄封閉液，迅速加入5ml新的封閉液，側(cè)擺搖床20-30rpm，室溫lh。
[0021] 3)血清樣本孵育：倒棄封閉液，迅速加入預(yù)先準(zhǔn)備好的蛋白樣本孵育液3ml，側(cè)擺 搖床20-30rpm，室溫3h。蛋白樣本孵育液:3ml孵育液加入30μ1血清(新鮮制備或凍存于-80 度，由專利申請人提供）。
[0022] 4)清洗:將芯片取出，置于加入有40ml清洗液的芯片清洗盒，劇烈晃動10-15次，并 更換清洗液，再次劇烈晃動10-15次，充分去除游離一抗;再次更換清洗液，至于水平搖床 上，60_70rpm，5min每次，清洗3次。
[0023] 5)二抗孵育：倒棄清洗液，迅速加入預(yù)先準(zhǔn)備好的二抗孵育液3ml，側(cè)擺搖床20- 30rpm，避光，室溫45min。二抗孵育液:使用anti-human IgG焚光二抗(549anti-人IgG，激發(fā) 光532nm，或635anti_人IgM，激發(fā)光635nm，Jackson ImmunoResearch)，孵育液稀釋抗體至 其工作液濃度，總體積為3ml。二抗孵育時避光。
[0024] 6)清洗:同步