預處理方法及阿莫西林、青霉素g和青霉素v的檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及一種預處理方法及阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V的檢測方法。
【背景技術】
[0002] 阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V是畜牧業(yè)最常用的獸藥，都屬于β-內酷胺類抗生素， 是青霉素類廣譜抗生素。阿莫西林，又名安莫西林或安默西林，其殺菌作用強，穿透細胞膜 的能力強，是目前應用較為廣泛的口服青霉素之一。青霉素 G又被稱為盤尼西林、青霉素鋼、 節(jié)青霉素鋼、青霉素鐘或節(jié)青霉素鐘等。青霉素 G是抗菌素的一種，是從青霉菌培養(yǎng)液中提 制的分子中含有青霉燒、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗 生素，對多數革蘭陽性菌、革蘭陰性球菌、個別革蘭陰性桿菌(如嗜血桿菌屬）、螺旋體和放 線菌均有抗菌活性，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素 V抗菌譜與青霉素 G相同， 但對產β內酷胺酶的菌株無抗菌作用，比如金黃色葡萄球菌和凝固酶陰性葡萄球菌等。青霉 素 V與青霉素 G相比，對大多數敏感菌株的活性弱2~5倍。青霉素 V的作用機制也是抑制細菌 細胞壁的合成，使細菌迅速破裂而溶解。
[0003] 牛奶是一種大眾日常的消費品，隨著人們對食品安全要求日益提高，牛奶的安全 質量問題也越來越為人們重視。但從我國國內養(yǎng)殖環(huán)境來看，在我國大部分地區(qū)，特別是廣 大農村地區(qū)的養(yǎng)殖動物和生產飼料過程中，仍存在超量或超范圍使用抗生素、不嚴格執(zhí)行 藥物配伍禁忌或停藥期規(guī)定的情況，甚至會存在使用違禁抗生素等現象。因食物鏈傳遞，牛 奶中大量殘留的抗生素會對人體造成危害。另外，從乳制品加工的角度來看，原料乳中殘留 的抗生素會嚴重影響干酪、黃油和發(fā)酵乳的起酵或后期風味的形成。
[0004] 現有技術中，原料乳和/或液態(tài)乳制品中殘留的阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V含量 的檢測方法主要有高效液相色譜法化PLC)、液相色譜-質譜化PLC-MS/MS)和酶聯免疫方法 等；其預處理多采用液液萃取和固相萃取等方法，國標方法預處理方法采用3步固相萃取 法。目前現有的固相萃取預處理方法主要包括:活化、上樣、淋洗和收集流出液，其中，淋洗 和收集流出液所占時間占前處理所需時間的80%左右。故現有的固相萃取預處理方法存在 的問題是操作步驟多、耗時長、有機溶劑使用量大W及不利于環(huán)保的缺陷。該現象亟待解 決。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題是克服了現有技術對原料乳和/或液態(tài)乳制品中殘留 的阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的一種或多種的含量進行檢測前，其固相萃取預處理方 法操作步驟多、耗時長W及有機溶劑使用量大的缺陷，提供了一種預處理方法及阿莫西林、 青霉素 G和青霉素 V的檢測方法。本發(fā)明的預處理方法快速、簡單、經濟、可靠，能夠有效地提 取出待測組分，去除復雜基質影響，有益于待測樣品的快速檢測。而且在保持較高提取率的 同時，節(jié)約了有機溶劑的使用、排放和損失，有利于保護環(huán)境，節(jié)約了預處理步驟、時間和能 耗，具有較強的應用價值。本發(fā)明的檢測方法可用于檢測阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的 一種或多種，且檢測方法快速，簡單，精密度高，準確性高。
[0006] 本發(fā)明通過W下技術方案解決上述技術問題。
[0007] 本發(fā)明提供了一種預處理方法，其包括W下步驟：
[0008] (1)將待測樣品和乙臘的混合物，離屯、，收集上清液;所述的待測樣品為不含固體 顆粒的乳制品；
[0009] (2)將所述上清液上樣至已經活化的Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，收集流出 液，即得預處理后的待測樣品。
[0010] 步驟(1)中，所述的待測樣品較佳地為原料乳和/或液態(tài)乳制品。
[0011] 其中，所述的液態(tài)乳制品為本領域常規(guī)的液態(tài)乳制品，較佳地為高巧牛奶、高鐵牛 奶、低乳糖牛奶和低脂牛奶中的一種或多種，更佳地為高巧牛奶、低乳糖牛奶和高鐵牛奶中 的一種或多種。
[0012] 其中，所述的原料乳為本領域常規(guī)的原料乳，較佳地為牛乳。除所述待測組分外， 所述牛乳的成分及含量一般如表1所示：
[0013] 表1
[0014]
[0015] 其中，百分比為各組分相對于牛乳的質量百分比。
[0016] 步驟(1)中，所述的待測樣品可能含有阿莫西林、青霉素 G和青霉素 V中的一種或多 種。該些組分可能是由于養(yǎng)殖動物和生產飼料過程中，超量或超范圍使用抗生素、不嚴格執(zhí) 行藥物配伍禁忌或停藥期規(guī)定或使用違禁抗生素等現象造成的。
[0017] 步驟（1)中，所述的待測樣品中，阿莫西林的含量較佳地為4~1000yg/Kg，更佳地 為10~5(K)yg/Kg，最佳地為10~50yg/Kg。所述的待測樣品中，青霉素 G的含量較佳地為4~ 1000yg/Kg，更佳地為10~500yg/Kg，最佳地為10~50yg/Kg。所述的待測樣品中，青霉素 V的 含量較佳地為5~1000yg/Kg，更佳地為10~500yg/Kg，最佳地為10~50yg/Kg。
[0018] 步驟（1)中，所述乙臘的添加量為本領域常規(guī)的添加量，較佳地為3~40mL/l~4g 待測樣品，更佳地為4~lOmL/lg待測樣品。
[0019] 步驟(1)中，較佳地，在所述離屯、的操作之前，先將所述混合物進行縱滿震蕩。所述 旋滿震蕩的方法和條件為本領域常規(guī)的方法和條件，所述的旋滿震蕩的時間較佳地為1~ lOmin，更佳地為5min。所述縱滿震蕩的溫度本領域常規(guī)，一般為室溫。所述旋滿震蕩是為了 利于提取，使乙臘進一步提取所述待測成分。
[0020] 步驟(1)中，較佳地，所述混合物中還包含酸。所述酸為本領域常規(guī)的酸，較佳地為 甲酸和/或乙酸。所述酸的添加量為本領域常規(guī)，較佳地為ο. 1~2%，更佳地為ο. 8~1.2 %， 最佳地為1%;上述百分比為所述酸占所述乙臘的體積百分比。添加所述酸后，所述待測樣 品中所述阿莫西林、所述青霉素 G或所述青霉素 V的提取率至少能提高10% W上。
[0021] 步驟（1)中，根據本領域常識，可使用乙臘和酸進行多次離屯、操作，較佳地使用乙 臘和酸進行兩次離屯、操作。所述酸的種類和用量如前所述。根據本領域常識，將多次離屯、后 所得上清液進行合并。
[0022] 步驟(1)中，所述的離屯、的方法和條件為本領域常規(guī)的方法和條件。所述的離屯、的 轉速較佳地為5000~1500化pm。所述的離屯、的時間較佳地為5~30min。
[0023] 步驟(1)中，較佳地，將所述上清液先進行定容后再進行步驟(2)的操作。所述定容 的操作過程中，較佳地使用水或乙臘進行定容，更佳地使用乙臘進行定容。所述定容的終點 較佳地為10~25mL/g所述待測樣品，更佳地為lOmL/g所述待測樣品。所述定容的目的是為 了使后續(xù)進行測試時，用量基本相同。
[0024] 步驟(2)中，所述Oasis P化ME化B固相萃取小柱較佳地為沃特世科技(上海)有限 公司市售產品。
[0025] 步驟(2)中，所述活化的操作和條件為本領域常規(guī)的操作和條件?；罨捎玫娜軇?種類較佳地為乙臘水溶液或甲醇水溶液。所述乙臘水溶液中，乙臘占水的體積百分比較佳 地為10~80%，更佳地為60%。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的體積百分比較佳地為10~ 80 %，更佳地為60 %。所述乙臘水溶液或所述甲醇水溶液的用量為本領域常規(guī)，較佳地為3 ~8mL，更佳地為4mL。
[0026] 步驟(2)中，所述上清液在所述固相萃取小柱中的流速為本領域常規(guī)的流速，較佳 地為0.025 ~0.30mL/s，更佳地為 0.05mL/s。
[0027] 本發(fā)明還提供一種待測成分的檢測方法，所述待測成分為阿莫西林、青霉素 G和青 霉素 V中的一種或多種，其包括W下步驟：
[0028] (1)將所述預處理后的待測樣品去除溶劑，再用溶劑A溶解，過濾，得進料樣品；所 述溶劑A為甲醇水溶液、乙臘水溶液或水；
[0029] (2)將步驟（1)中所述進料樣品再進行高效液相色譜-電噴霧串聯二級質譜化C- MS/MS)檢測所述待測成分，即可。
[0030] 步驟(1)中，所述去除溶劑的方法和條件為本領域常規(guī)，較佳地用20~50°C氮氣吹 干，更佳地為用25°C氮氣吹干。
[0031] 步驟(1)中，所述乙臘水溶液中，乙臘占水的體積百分比較佳地為1~20%，更佳地 為6%。所述甲醇水溶液中，甲醇占水的體積百分比較佳地為1~20%，更佳地為6%。
[0032] 步驟（1)中，所述溶劑A的用量較佳地為1~2mL/g所述待測樣品，更佳地為ImL/g所 述待測樣品。
[0033] 步驟(1)中，所述的過濾的方法為采用有機微孔濾膜進行過濾，較佳地采用孔徑為 0.22WI1或0.45WI1的有機微孔濾膜進行過濾。根據本領域常識，所述的過濾為微濾。
[0034] 步驟(2)中，所述的高效液相色譜-電噴霧串聯二級質譜化C-MS/MS)檢測的條件和 方法為本領域常規(guī)的條件和方法。
[0035] 步驟(2)所述的高效液相色譜-電噴霧串聯二級質譜檢測中，高效液相色譜法檢測 的色譜柱較佳地為十八硅烷鍵合硅膠色譜柱(Water Xselect Ci8 column)。所述的十八娃 燒鍵合硅膠色譜柱的規(guī)格較佳地為4