例稀釋，用vortex混勻。該過程需要盡量避光。
[0069] 量取180uL稀釋后的血液樣品和60uL稀釋的Magnesium green加入2mL EP管，輕柔 的搖晃管子混勻，并放入37°C水浴鍋內(nèi)1小時。孵育過程中每6~8分鐘晃動EP管一次，以防 止血細(xì)胞沉降。
[0070] 1小時后，取出管子擦干。向每管加入1700uL工作液，清洗熒光染料。輕柔顛倒混 勻，并在lOOOrpm室溫離心3分鐘。離心完畢，用移液器小心的取出上清液棄掉，向管底的紅 細(xì)胞加入180uL工作液，輕搖管子重懸;亦可用剪口的移液槍頭吹吸混勻。重懸細(xì)胞后，按以 上過程重新清洗一次并用180uL工作液重懸。
[0071] 將洗過的紅細(xì)胞放回37°C水浴放置30分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的熒光指示劑與鎂離子充分 結(jié)合。
[0072] 孵育完成后取出管子擦干，放入暗盒內(nèi)等待測量。
[0073] 4、流式細(xì)胞儀檢測
[0074] 樣品使用BD FACS Calibur型號流式細(xì)胞儀檢測。
[0075]取樣過程如圖1所示，圖la，在前向角和側(cè)向角(FSC/SSC)圖像中選取紅細(xì)胞象限， 記為R1;圖lb，采用FL1通道測量熒光強度，在FL1直方圖中，x軸表示熒光強度(FLl)，y軸表 示每個熒光強度對應(yīng)的紅細(xì)胞個數(shù)(counts)。以圖la中R1象限為基礎(chǔ)進一步選取熒光峰的 門Ml。統(tǒng)計時取Ml門內(nèi)10000個細(xì)胞，讀取其平均熒光強度。
[0076] 5、鎂離子實際濃度校準(zhǔn)(標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立）
[0077]用不含鈣鎂離子的HBSS與MgS〇4制備生理范圍鎂離子濃度梯度。
[0078]將步驟3得到的紅細(xì)胞多份平行樣本用HBSS(不含鈣、鎂)洗2遍，將其與鎂離子濃 度梯度溶液混合。向各管中加入鈣鎂離子載體A23187至終濃度25ymol/L，使紅細(xì)胞內(nèi)外的 鎂離子濃度平衡。37°C水浴2小時后，取出后將管子擦干，測量熒光強度。以標(biāo)準(zhǔn)樣品鎂離子 濃度梯度和對應(yīng)的熒光強度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖2所示為鎂離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖：測量鎂離 子濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)樣，以熒光強度值為橫軸，鎂離子濃度為縱軸，做指數(shù)回歸曲線，計算曲線 方程。將待測樣品的熒光強度值代入曲線方程，求得樣品實際鎂離子濃度。
[0079]圖3為應(yīng)用性實例之一:本發(fā)明實測的紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃度RBC[Mg2+]i)能有 效反映動物飲食鎂攝入量變化。小鼠喂養(yǎng)普通鎂飼料(含鎂量0.15%，質(zhì)量百分比）或低鎂 飼料(含鎂量0.003% )4周后，低鎂組RBC[Mg2+]^E常組顯著下降（t檢驗，p〈0.001，誤差線 表示標(biāo)準(zhǔn)差(SD))。
[0080]圖4為應(yīng)用性實例之二:本發(fā)明實測的RBCWgli有效反映了糖尿病模型小鼠的身 體鎂流失情況，以及外源性鎂補償?shù)幕謴?fù)效果。ICR小鼠分別以正常食物(NC)，高熱量食物 (HC)，高熱量食物加含鎂藥物(HC+Mg)喂養(yǎng)12個月后，高熱量組比正常組的空腹血糖（如圖 4a)和空腹血清胰島素(如圖4b)濃度顯著上升(p〈0.001)，顯示出高熱量組產(chǎn)生了胰島素耐 受和糖尿病病發(fā)癥狀，模型構(gòu)建是成功的；此時高熱量組比正常組的RBCWf+l·(如圖4c)顯 著下降(p〈0.01)，顯示出糖尿病癥狀引起了小鼠身體的鎂流失。在對高熱量組小鼠補充鎂 攝入后，RBCWgli(如圖4c)的下降得到了恢復(fù)，而此時空腹血糖(如圖4a)和空腹血清胰島 素(如圖4b)都回到了正常水平，顯示出鎂補充對糖尿病小鼠的治療效果。（各圖中誤差線表 示標(biāo)準(zhǔn)差(SD))
[0081 ]圖5為應(yīng)用性實例之三:本發(fā)明實測的RBC[Mg2+]i有效反映了動物在衰老過程中的 身體鎂流失情況。統(tǒng)計不同月齡ICR雌性小鼠的RBC[Mg2+ ] i。以月齡為橫軸，RBC[Mg2+ ] i為縱 軸作圖，可以發(fā)現(xiàn)在衰老過程中，雌性ICR小鼠出現(xiàn)了RBCWgli伴隨月齡下降的狀況，其中 2.5月齡、3月齡小鼠分別與18月齡小鼠有顯著差異;提示RBC[Mg 2+]^反映衰老引起的身體 儀流失。
[0082]圖6為應(yīng)用性實例之四：本發(fā)明實測的RBC[Mg2+]i能有效表征動物記憶力水平，并 能預(yù)測含鎂藥物對老年大鼠記憶力損傷的恢復(fù)效果。檢測老年雄性SD大鼠的RBC[Mg2+]g 空間記憶力（T迷宮實驗）。圖6a，以RBCtMgli為橫軸，空間記憶力得分為縱軸作圖。可見鎂 離子濃度與空間記憶力線性正相關(guān)妒=〇.64，？ = 0.0006);提示1^[1%2+]河以表征老年 動物個體的記憶力水平。圖6b，圖6c，對老年大鼠給予藥物鎂補充后，動物個體記憶力提升 的幅度不同，基礎(chǔ)RBCWgli越低的個體，給藥前后記憶力提升的差值(給藥后行為實驗得 分減去給藥前的）越大；顯示RBCtMghh可以預(yù)測含鎂藥物恢復(fù)老年大鼠記憶力損傷的效 果。
[0083] 實施例2:
[0084]表1:本發(fā)明測量RBC[Mg2+] i的質(zhì)量檢驗（回收率和離散度）。制備標(biāo)準(zhǔn)生理鎂離子 濃度的紅細(xì)胞樣品（序號1~3)，用本方法檢測其實際濃度，計算回收率;可見標(biāo)準(zhǔn)樣品的平 均回收率在98 %~102 %之間，測量技術(shù)很好的重現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)樣品的真實值，顯示本方法的精 確性。序號4和5是對實際動物血液樣本的測量，其中4號為一只年輕大鼠，5號為一只年老大 鼠；可見每只動物重復(fù)測量三次(A，B，C)的離散度均在2%以下，顯示本方法的穩(wěn)定性;同時 測量結(jié)果年輕大鼠均值為〇. 27mmol/L，年老大鼠均值為0.20mmol/L，顯示出衰老伴隨的鎂 流失，這與以往文獻和我們的研究發(fā)現(xiàn)是一致的。
[0085] 表1 RBC[Mg2+]i測量技術(shù)的質(zhì)量控制
[0086]
【主權(quán)項】
1.以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方法，其特征在 于:包括以下步驟： 1】試劑準(zhǔn)備： 生理緩沖液，無菌，冷藏； 鎂鹽； 血液抗凝劑，冷藏； 細(xì)胞膜透過性鎂離子熒光指示劑，冷凍； 助溶劑(Pluronic F-127)，室溫； 鈣鎂離子載體，冷凍； 2】取血： 將血液抗凝劑加入EP管內(nèi)，后取動物靜脈血沿管壁加入EP管中，及時混勻，得到全血樣 品待用； 3】樣品處理和孵育： 3.1】用漢克斯平衡液稀釋鎂鹽至生理鎂離子濃度，調(diào)節(jié)至生理PH值，制得工作液，放于 室溫備用； 3.2】將步驟2】得到的全血樣品用步驟3.1】制備的工作液稀釋至紅細(xì)胞濃度3~9 X 109 個/L左右，放于室溫備用； 3.3】將冷凍的鎂離子熒光指示劑取出，手握至融化，向其中按體積比1:1.25加入助溶 劑Pluronic F-127混勻;然后在避光的條件下與工作液混合，并用漩渦振蕩器混勻； 3.4】在EP管中將3.2】稀釋后的全血樣品與步驟3.3】制得的含鎂離子熒光指示劑的工 作液混合均勻，后放入水浴，做第一次孵育，并每間隔6-8分鐘晃動EP管一次； 3.5】孵育完成后，向EP管中加入工作液，搖晃重懸，后室溫離心； 3.6】用移液器取出上清液棄掉，向管底的紅細(xì)胞沉淀加入工作液，輕搖EP管重懸;或用 剪口的移液槍頭吹吸重懸； 3.7】再一次執(zhí)行步驟3.6】； 3.8】重懸后的紅細(xì)胞放入水浴進行第二次孵育，使紅細(xì)胞內(nèi)的鎂離子熒光指示劑與細(xì) 胞內(nèi)游離鎂離子充分結(jié)合； 3.9】第二次孵育完成后取出管子擦干，放入暗盒內(nèi)等待測量熒光強度； 4】建立紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線： 4.1】用漢克斯平衡液與硫酸鎂或氯化鎂制備符合生理范圍的鎂離子濃度梯度溶液； 4.2】將步驟3.9】得到的紅細(xì)胞多份平行樣本并用漢克斯平衡液洗，后與步驟4.1】制備 的鎂離子濃度梯度溶液混合，向各管中加入鈣鎂離子載體，使得紅細(xì)胞內(nèi)外的鎂離子濃度 平衡； 4.3】37°C水浴1~3小時，取出后將管子擦干，放入暗盒內(nèi)等待測量熒光強度； 4.4】以鎂離子濃度梯度溶液和對應(yīng)樣品的熒光強度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5】用流式細(xì)胞儀測量樣本的熒光強度值： 將3.9】和4.3】步得到的樣本注入流式細(xì)胞儀，在前向角/側(cè)向角圖像中選取紅細(xì)胞象 限，進一步在熒光強度直方圖中選取熒光峰，讀取其平均熒光強度值； 6】將5】得到的的平均熒光強度值代入4.4】得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本細(xì)胞內(nèi)游離鎂離 子濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃 度的方法，其特征在于：焚光指示劑為Invitrogen公司生產(chǎn)的Magnesium green，其工作濃 度2~10ymol/L。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃 度的方法，其特征在于:所述動物靜脈血為大鼠尾靜脈血、小鼠球后靜脈叢血、人肘靜脈血 或指尖血。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離 鎂離子濃度的方法，其特征在于:步驟3.2】中將步驟2】得到的全血樣品用步驟3.1】制備的 工作液稀釋至紅細(xì)胞濃度為5~7 X 109個/L。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離 鎂離子濃度的方法，其特征在于：稀釋紅細(xì)胞的生理緩沖液為漢克斯平衡液（Hanks Balanced Salts，HBSS);所含生理濃度鎂鹽為硫酸鎂或氯化鎂。6. 根據(jù)權(quán)利要求1和3之任一所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游 離鎂離子濃度的方法，其特征在于:血液抗凝劑為肝素。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃 度的方法，其特征在于:第一次孵育，水浴溫度為37°C，40~80分鐘。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃 度的方法，其特征在于:第二次孵育，水浴溫度為37°C，25~50分鐘。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃 度的方法，其特征在于:使用的鈣鎂離子載體為A23187,其工作濃度20~75ymol/L。10. 游離鎂離子在制備提高記憶力藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種以熒光指示劑結(jié)合流式細(xì)胞技術(shù)測量紅細(xì)胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方法，目的在于精準(zhǔn)測量一種與大量生命活動息息相關(guān)的內(nèi)源性金屬離子——鎂離子在紅細(xì)胞內(nèi)游離狀態(tài)下的濃度水平(RBC[Mg2+]i)。采用鎂離子熒光探針結(jié)合流式細(xì)胞的技術(shù)，具有測量迅速實時，操作簡單方便；樣本采集通量高，測量結(jié)果精確穩(wěn)定等優(yōu)點。由本發(fā)明測量的RBC[Mg2+]i可以有效表征飲食攝取匱乏、糖尿病和衰老過程中動物身體的鎂流失；并能有效指征老年動物的記憶力水平，以及預(yù)測外源性鎂補償治療老年動物記憶損傷的用藥效果。用本發(fā)明測量出的RBC[Mg2+]i，可能是一種潛在的臨床生理指標(biāo)，將為健康飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)理，疾病診斷和監(jiān)控，以及個體化精準(zhǔn)醫(yī)療用藥提供參考標(biāo)準(zhǔn)。
【IPC分類】G01N15/14, G01N1/28, G01N1/38
【公開號】CN105572018
【申請?zhí)枴緾N201510901399
【發(fā)明人】康敏
【申請人】康敏
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月8日