以熒光指示劑結(jié)合流式細胞技術(shù)測量紅細胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及以熒光指示劑結(jié)合流式細胞方法測量紅細胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 生命科學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床領(lǐng)域已經(jīng)報道了人體和動物內(nèi)源性鎂含量與生理病理 進程有密切聯(lián)系。測量生物內(nèi)源性鎂水平對科學(xué)研究、臨床監(jiān)測和用藥參考有重要的意義。 目前針對生物內(nèi)源性鎂水平的測量，在技術(shù)手段上多種多樣，在檢測靶點上也五花八門，很 多已報道的技術(shù)都存在精確度低，適用性狹窄的問題。
[0003] 生物體內(nèi)各個組織、細胞和體液中的鎂總體上可分為游離鎂和結(jié)合鎂兩類。大量 文獻報道顯示:細胞內(nèi)游離鎂直接結(jié)合諸如ATP、酶、細胞膜受體等生物分子，參與調(diào)節(jié)生命 活動;細胞內(nèi)游離鎂對一些鎂代謝異常相關(guān)的生理病理發(fā)展進程更具表征功能。諸如腦、肌 肉組織的游離鎂已經(jīng)被用來研究對應(yīng)疾病伴隨的鎂流失，但它們存在應(yīng)用局限性。而血液 鎂組分通過全身血液循環(huán)和鎂離子交換，調(diào)解機體各組織的鎂水平;血細胞游離鎂具有廣 泛表征機體各組織鎂水平，并指示多種生理病理發(fā)展進程的潛在能力。
[0004] 現(xiàn)有的測量細胞內(nèi)游離鎂的技術(shù)主要有核磁共振法和熒光指示劑法。核磁共振法 實質(zhì)測量的是細胞內(nèi)磷含量，再用鎂離子與含磷ATP的結(jié)合參數(shù)換算出鎂離子含量，是一種 很間接的技術(shù)，干擾因素多；并且核磁共振技術(shù)主要應(yīng)用于組織層面，對懸浮的紅細胞測量 精度較低；它需要的采血量也多，遠大于我們的技術(shù)（10mL對比lOOyL)目前核磁共振法測量 血紅細胞游離鎂僅應(yīng)用于幾例糖尿病、高血壓的鎂流失研究。熒光指示劑法采用細胞透過 性探針直接結(jié)合細胞內(nèi)游離鎂，進而產(chǎn)生熒光，熒光強度與游離鎂水平高度對應(yīng)(見圖2)， 精度更高。已有的文獻報道中，熒光指示劑法多用于測量貼壁培養(yǎng)的神經(jīng)元胞內(nèi)游離鎂離 子濃度，未見用于紅細胞測量。而神經(jīng)元游離鎂的熒光檢測和校準(zhǔn)過程復(fù)雜，涉及專業(yè)圖像 處理軟件和大量手動處理，不適用于懸浮紅細胞的大樣本量檢測。另外，以往使用的許多熒 光指示劑的發(fā)射峰波長隨著鎂離子濃度的變化而迀移，測量時操作繁瑣，用熒光強度換算 鎂離子真實濃度時也容易引入誤差。同時，一些技術(shù)采用熒光顯微鏡檢測熒光指示劑，這類 熒光定量額度精度低。
[0005] 概括來看，現(xiàn)有測量細胞內(nèi)游離鎂的技術(shù)存在精度低、樣品需求量大、不適合用于 測紅細胞，操作方法繁瑣、干擾因素多等缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決【背景技術(shù)】中所存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種以熒光指示劑結(jié)合流式 細胞技術(shù)測量紅細胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)解決方案：
[0008] 以熒光指示劑結(jié)合流式細胞技術(shù)測量紅細胞內(nèi)游離鎂離子濃度的方法，其特殊之 處在于:包括以下步驟：
[0009] 1】試劑準(zhǔn)備：
[0010] 生理緩沖液(不含鈣、鎂），無菌，冷藏；
[0011] 鎂鹽；
[0012]血液抗凝劑，冷藏；
[0013]細胞膜透過性鎂離子熒光指示劑，冷凍；
[0014]助溶劑(Pluronic F-127)，室溫；
[0015]鈣鎂離子載體，冷凍；
[0016] 2】取血：
[0017]將血液抗凝劑加入EP管內(nèi)，后取動物靜脈血沿管壁加入EP管中，及時混勻，得到全 血樣品待用；
[0018] 3】樣品處理和孵育：
[0019] 3.1】用漢克斯平衡液稀釋鎂鹽至生理鎂離子濃度，調(diào)節(jié)至生理PH值，制得工作液， 放于室溫備用；
[0020] 3.2】將步驟2】得到的全血樣品用步驟3.1】制備的工作液稀釋至紅細胞濃度3~9 X 109個/L左右，放于室溫備用；
[0021] 3.3】將冷凍的鎂離子熒光指示劑取出，手握至融化，向其中按體積比1:1.25加入 助溶劑Pluronic F-127混勻;然后在避光的條件下與工作液混合，并用漩渦振蕩器混勻； [0022] 3.4】在EP管中將3.2】稀釋后的全血樣品與步驟3.3】制得的含鎂離子熒光指示劑 的工作液混合均勻，后放入水浴，做第一次孵育，并每間隔6-8分鐘晃動EP管一次；
[0023] 3.5】孵育完成后，向EP管中加入工作液，搖晃重懸，后室溫離心；
[0024] 3.6】用移液器取出上清液棄掉，向管底的紅細胞沉淀加入工作液，輕搖EP管重懸； 或用剪口的移液槍頭吹吸重懸；
[0025] 3.7】再一次執(zhí)行步驟3.6】；
[0026] 3.8】重懸后的紅細胞放入水浴進行第二次孵育，使紅細胞內(nèi)的鎂離子熒光指示劑 與細胞內(nèi)游離鎂離子充分結(jié)合；
[0027] 3.9】第二次孵育完成后取出管子擦干，放入暗盒內(nèi)等待測量熒光強度；
[0028] 4】建立紅細胞內(nèi)游離鎂離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線：
[0029] 4.1】用漢克斯平衡液與硫酸鎂或氯化鎂制備符合生理范圍的鎂離子濃度梯度溶 液；
[0030] 4.2】將步驟3.9】得到的紅細胞多份平行樣本并用漢克斯平衡液洗，后與步驟4.1】 制備的鎂離子濃度梯度溶液混合，向各管中加入鈣鎂離子載體，使得紅細胞內(nèi)外的鎂離子 濃度平衡；
[0031] 4.3】37°C水浴1~3小時，取出后將管子擦干，放入暗盒內(nèi)等待測量熒光強度；
[0032] 4.4】以鎂離子濃度梯度溶液和對應(yīng)樣品的熒光強度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0033] 5】用流式細胞儀測量樣本的熒光強度值：
[0034] 將3.9】和4.3】步得到的樣本注入流式細胞儀，在前向角/側(cè)向角圖像中選取紅細 胞象限，進一步在熒光強度直方圖中選取熒光峰，讀取其平均熒光強度值；
[0035] 6】將5】得到的的平均熒光強度值代入4.4】得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算樣本細胞內(nèi)游離 鎂離子濃度。
[0036] 焚光指不劑為Invitrogen公司生產(chǎn)的Magnesium green，其工作濃度2~ΙΟμ mol/ L〇
[0037] 上述動物靜脈血為大鼠尾靜脈血、小鼠球后靜脈叢血、人肘靜脈血或指尖血。
[0038] 步驟3.2】中將步驟2】得到的全血樣品用步驟3.1】制備的工作液稀釋至紅細胞濃 度為5~7X109個/L。
[0039] 稀釋紅細胞的生理緩沖液為漢克斯平衡液(Hanks Balanced Salts，HBSS);所含 生理濃度鎂鹽為硫酸鎂或氯化鎂。
[0040]血液抗凝劑為肝素。
[0041 ] 第一次孵育，水浴溫度為37°C，40~80分鐘。
[0042] 第二次孵育，水浴溫度為37°C，25~50分鐘。
[0043] 使用的鈣鎂離子載體為A23187,其工作濃度20~75ymol/L。
[0044] 游離鎂離子在制備提高記憶力藥物中的應(yīng)用。
[0045] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0046] 1、本發(fā)明專門針對測量血紅細胞這一特定細胞群的胞內(nèi)鎂離子含量，具有取樣迅 速、實時、微創(chuàng)，操作簡單便捷的優(yōu)點。流失細胞技術(shù)的應(yīng)用更保證了樣品檢測的高通量和 特異性。
[0047] 2、本發(fā)明測量精度高。以本發(fā)明測量標(biāo)準(zhǔn)鎂離子濃度樣品的回收率在98 %~ 102%之間，重復(fù)測量樣品的離散度不超過2%，具體如表1所示。
[0048] 3、本發(fā)明應(yīng)用面廣，對多種生理病理進程都有表征作用。使用本發(fā)明測出的紅細 胞內(nèi)游離鎂離子濃度(RBCtMg2、），已經(jīng)用于監(jiān)測大小鼠飲食鎂營養(yǎng)攝入量變化;研究糖尿 病模型小鼠的身體鎂流失狀況和含鎂藥物補償治療;研究大小鼠衰老過程伴隨的身體鎂流 失狀況和含鎂藥物對老年大鼠記憶力減退的治療;研究阿爾茨海默癥模型小鼠的機體鎂流 失狀況和含鎂藥物對其記憶力減退的治療等。值得特別強調(diào)的是，由本發(fā)明測量出的動物 RBC[Mg2+]4〖直接表征大小鼠記憶力水平，這是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域一項原創(chuàng)性的重要發(fā)現(xiàn)。以上 發(fā)現(xiàn)有助于研究內(nèi)源性鎂在生理活動和某些相關(guān)疾病發(fā)病進程中扮演的重要角色，以及含 鎂藥物治療相關(guān)疾病的作用機理。我們預(yù)計這些大小鼠上的科學(xué)發(fā)現(xiàn)將同樣適用于人體研 究，現(xiàn)已開展臨床研究。未來臨床上使用本發(fā)明檢測人體鎂含量水平，將為健康飲食結(jié)構(gòu)的 調(diào)理，鎂缺失相關(guān)疾病的早期診斷和預(yù)防，以及含鎂藥物用藥劑量的判定和個體化精準(zhǔn)治 療等多方面提供有效的參考標(biāo)準(zhǔn)，有用作臨床生理指標(biāo)的潛在可能。
【附圖說明】
[0049] 圖1為流式細胞儀的圖像分析，選取象限和門的示意圖；
[0050] 圖2為鎂離子濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的示意圖；
[0051]圖3為本發(fā)明實測的1^(：[1%2+]1有效反映動物飲食鎂攝入量變化的科學(xué)研究結(jié)果； [0052]圖4為本發(fā)明實測的RBC[Mg2+]i有效反映糖尿病(高脂食物)模型小鼠身體鎂流失 情況的科學(xué)研究結(jié)果；
[0053]圖5為本發(fā)明實測的RBC[Mg2+]i有效反映動物在衰老過程中身體鎂流失情況的科 學(xué)研究結(jié)果；
[0054]圖6為本發(fā)明實測的RBC[Mg2+]i有效表征動物記憶力（T maze實驗）的科學(xué)研究結(jié) 果。
【具體實施方式】 [0055] 實施例1:
[0056] 1、試劑材料
[0057] 漢克斯平衡液Hanks Balanced Salts(HBSS，Sigma_Aldrich)，不含|丐儀離子，PH =7.4，無菌，4°0儲存；
[0058] 80mmol/L MgS〇4(溶于去離子水），4°C儲存；
[0059]肝素 Heparin，4°C 儲存；
[0060] 細胞膜透過性鎂離子焚光指示劑Magnesium green(MaG, Invitrogen) lg/L溶于 DMSO，分裝為10ul/管，-20°C儲存；
[0061 ]助溶劑Pluronic F_127(Invitrogen)，室溫儲存；
[0062] 鈣鎂離子載體厶23187(5181^-厶1辦1吐），-20°(3儲存；
[0063] 2、取血
[0064] 將heparin提前加入200uL EP管內(nèi)（與目標(biāo)采血量體積比為1:20~1:50)，取動物 靜脈血(大鼠尾靜脈血，小鼠球后靜脈叢血，人肘靜脈血或指尖血)沿管壁加入EP管中，及時 并輕柔的混勻。
[0065] 3、樣品處理和孵育：
[0066] 用HBSS儲備液稀釋80mmol/L MgS〇4至0.5mmol/L，調(diào)節(jié)PH值至7.4，放置到室溫后 使用，下文簡稱為"工作液"。
[0067] 在2mL EP管中，用含0.5mmol/L MgS〇4的HBSS(工作液)將全血稀釋1200倍，輕柔的 反復(fù)顛倒管子混勻，備用。此時血紅細胞約為3X109個/L，可用細胞計數(shù)板測量以確定。 [0068]迅速將熒光指示劑MaG從_20°C取出，手握融化。向其中加入F-127,加入量為1體積 MaG體積對應(yīng)1.25倍體積F-127。用移液器迅速混勻。按1體積MaG對應(yīng)50倍體積工作液的比