構(gòu)象柔性，
[0085] -增加 Asp殘基C-端氨基酸殘基的大小。
[0086]在一個(gè)實(shí)施方案中，Asp殘基C-端氨基酸殘基被改變?yōu)榇蟮陌被釟埢?br>[0087] 如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是選擇具有長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的抗體的方法，其包括以下 步驟：
[0088] a)針對(duì)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合 中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0089] b)針對(duì)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定該Asp或Asn殘基C-端氨基酸殘基的大 小，
[0090] c)選擇其中C。原子是非構(gòu)象柔性的和/或Asp或Asn具有大的C-端氨基酸殘基的抗 體。
[0091]如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是選擇一種或多種具有長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的抗體的方法， 其包括以下步驟：
[0092] a)提供兩種或更多種抗體，
[0093] b)針對(duì)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，使用同源物模型集合/在同源物模型集合 中/應(yīng)用同源物模型集合，確定C。原子的構(gòu)象柔性，
[0094] c)針對(duì)抗體Fv區(qū)中每個(gè)Asp和Asn殘基，確定該Asp或Asn殘基C-端氨基酸殘基的大 小，
[0095] d)選擇其中C。原子是非構(gòu)象柔性的和/或Asp或Asn具有大的C-端氨基酸殘基的抗 體，
[0096]由此選擇一種或多種具有長期儲(chǔ)存穩(wěn)定性的抗體。
[0097]如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是生產(chǎn)抗體的方法，其包括以下步驟：
[0098] a)培養(yǎng)包含核酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述核酸編碼用本文所報(bào)道的方法選擇的抗 體，或編碼用本文所報(bào)道的方法獲得的抗體，
[0099 ] b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，由此生產(chǎn)抗體。
[0100]如本文所報(bào)道的一個(gè)方面是生產(chǎn)抗體的方法，其包括以下步驟：
[0101] a)培養(yǎng)包含核酸的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述核酸編碼用本文所報(bào)道的方法選擇的抗 體，
[0102] b)從細(xì)胞或培養(yǎng)基中回收抗體，由此生產(chǎn)抗體。
[0103] 以下給出本文所報(bào)道的所有方面的實(shí)施方案。明確指出的是各實(shí)施方案的任何組 合也包括在此列中。
[0104]在一個(gè)實(shí)施方案中，構(gòu)象柔性是同源物模型集合中相應(yīng)Asn/Asp殘基的Ccc原子的 均方根偏差(RMSD)。在一個(gè)實(shí)施方案中同源物模型集合是集合(5元集）。
[0105]在一個(gè)實(shí)施方案
[0106] i)非構(gòu)象柔性是指RMSD是〇.〇 1A或更小，
[0107] ii)構(gòu)象柔性是指RMSD大于0.01又，
[0108] iii)中度構(gòu)象柔性指RMSD在0.145A和0.485蓋之間，和
[0109] iv)高度構(gòu)象柔性指RMSD大于0.485A。
[0110] 在一個(gè)實(shí)施方案中同源物模型集合由抗體Fv片段構(gòu)成。
[0111] 在一個(gè)實(shí)施方案中，小氨基酸殘基是61741&，5從，078或六叩。在一個(gè)實(shí)施方案中， 小氨基酸殘基是Gly，Ala，Ser或Cys。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法包括進(jìn)一步的步驟：
[0113]-提供抗體Fv區(qū)的氨基酸序列。
[0114] 在一個(gè)實(shí)施方案中高度溶劑暴露指SASA值大于89.4羞\(yùn)
[0115] 在一個(gè)實(shí)施方案中，使用統(tǒng)一的實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集生成同源物模型集合。
[0116] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)所有的CDR進(jìn)行環(huán)建模操作，得到五元同源物模型集合。 [0117]在一個(gè)實(shí)施方案中，方法不需要分子動(dòng)力學(xué)模擬。
[0118]在一個(gè)實(shí)施方案中，如果五元集合中的至少一個(gè)成員被分類為降解熱點(diǎn)，則殘基 算作降解熱點(diǎn)。
[0119]在一個(gè)實(shí)施方案中，使用單樹前看啟用遞歸分割算法（single-tree lookahead-enabled recursive partitioning algorithm)的Pipeline Pilot執(zhí)行。
[0120] 在一個(gè)實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)測定后續(xù)主鏈氮的溶劑可及表面積并計(jì)數(shù)氫鍵的數(shù) 目。
[0121] 在一個(gè)實(shí)施方案中，通過測量側(cè)鏈CY原子至Nn+1原子的距離、側(cè)鏈二面角XI和二面 角CG0NC(被定義為原子C Y、0、Nn+1和C之間的角度），探測了過渡態(tài)樣構(gòu)象。
[0122] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測定了每個(gè)Asp或Asn的溶劑可及表面積。
[0123] 在一個(gè)實(shí)施方案中，測定了C-端（后續(xù))氨基酸大小和主鏈二面角Φ (C'r^-N-Cf C '）和Φ(N_Ca-C ' _Nn+l)。
[0124]在一個(gè)實(shí)施方案中，同源物模型集合(5元集）中Asn/Asp殘基的Ca原子的均方根偏 差(RMSD)反映集合內(nèi)的結(jié)構(gòu)多樣性，其被視為可能的構(gòu)象柔性的指示。
[0125] 在一個(gè)實(shí)施方案中，包括二級(jí)結(jié)構(gòu)元素(殘基嵌在螺旋、片層、轉(zhuǎn)角或卷曲內(nèi)）、以 及至下一個(gè)不同的N-和C-端二級(jí)結(jié)構(gòu)元素的距離作為參數(shù)。
[0126] 在一個(gè)實(shí)施方案中，確定第n-Ι和第n+1殘基的Ca原子之間的距離。
[0127] 發(fā)明詳述
[0128] 單克隆抗體在多種多樣的適應(yīng)癥領(lǐng)域中是最有前景的蛋白質(zhì)治療劑。生產(chǎn)單克隆 抗體的標(biāo)準(zhǔn)方法通常導(dǎo)致幾種合適的候選物。必須從這些候選物中選擇化學(xué)穩(wěn)定的、具有 高治療效力的單克隆抗體，以避免在制造、存儲(chǔ)期間和在體內(nèi)的降解。抗體經(jīng)常通過天冬酰 胺(Asn)脫酰胺和天冬氨酸(Asp)異構(gòu)化降解。
[0129] Asn和Asp殘基通過形成環(huán)狀琥珀酰亞胺中間體具有在前的共同降解途徑（圖1) (3,5,33)。通過后續(xù)氨基酸的主鏈氮對(duì)Asn/Asp側(cè)鏈γ -羰基的親核攻擊，產(chǎn)生Asn脫酰胺或 Asp脫水，之后分子內(nèi)重排導(dǎo)致琥珀酰亞胺形成。該亞穩(wěn)態(tài)環(huán)狀酰亞胺可以在其兩個(gè)羰基之 一上水解，以不同比率形成天冬氨?；虍愄於滨ｆI，這取決于水解條件和構(gòu)象約束(3,5， 20,34-36)。此外，還提出了替代降解機(jī)制（10)，如通過主鏈羰基氧的親核攻擊以形成環(huán)狀 異酰亞胺（5,37,38)或通過Asn直接水輔助水解成Asp(39,40)。已經(jīng)描述了幾種分析方法， 多數(shù)為電荷-敏感的方法，如離子交換色譜或等電聚焦，以檢測任一降解產(chǎn)物，即琥珀酰亞 胺，Asp或異Asp(13，41，42)。最適于定量和定位蛋白質(zhì)中降解位點(diǎn)的是通過液相色譜串聯(lián) 質(zhì)譜(LC-MS/MS)的分析(12，13，38，43-50)。
[0130]根據(jù)37個(gè)單克隆抗體中位點(diǎn)特異性降解事件的統(tǒng)一實(shí)驗(yàn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)集，結(jié)合來自同 源物模型的結(jié)構(gòu)參數(shù)，已經(jīng)鑒定了在降解途徑中有貢獻(xiàn)的參數(shù)以及其各自的貢獻(xiàn)。已經(jīng)開 發(fā)了識(shí)別和選擇化學(xué)穩(wěn)定的單克隆抗體的方法。
[0131]術(shù)語"同源物模型"表示已經(jīng)得到的氨基酸序列的三維模型，其中，該三維模型通 過基于實(shí)驗(yàn)確定的相關(guān)同源氨基酸序列的參考結(jié)構(gòu)來構(gòu)建所討論的氨基酸序列的三維模 型(在一個(gè)實(shí)施方案中，三維原子分辨率模型）而獲得。同源物模型基于確定所討論的氨基 酸序列和參考氨基酸序列中可能具有相同結(jié)構(gòu)的（一般)序列元素(一個(gè)或多個(gè))和這些氨 基酸序列的(三維）比對(duì)而產(chǎn)生。
[0132] 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)是高度保守的，高水平的序列相似性通常意味著顯著的結(jié)構(gòu)相似 性（Marti-Renom，M.A.，et al·(2000)Annu.Rev.Biophys.Biomol·Struct·29:291-325)〇
[0133] 在一個(gè)實(shí)施方案中同源物模型由包括以下步驟的方法產(chǎn)生：
[0134] -參考結(jié)構(gòu)的選擇，
[0135] -所討論的序列與參考結(jié)構(gòu)的比對(duì)，
[0136] -模型構(gòu)建，和
[0137] -模型評(píng)估。
[0138] 可以使用任何比對(duì)方案，諸如例如?43了六，81^1'，？31-81^1'，實(shí)施序列的比對(duì)。
[0139] 在本發(fā)明的方法中使用的同源物模型可以是任何同源物模型，例如使用SWISS-模 型，CPH模型，MODELER或L00PER獲得的模型。在一個(gè)實(shí)施方案中同源物模型是通過使用 MODELER和L00PER算法獲得的。
[0140]使用程序MODELER 9v7的自動(dòng)化軟件腳本建立了同源物模型（83)。根據(jù)來自參考 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫的序列保守性選擇建模模板，該參考結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫由人、小鼠以及嵌合抗體Fab片 段晶體結(jié)構(gòu)組成，具有2.8A的最小分辨率，以及在其可變區(qū)沒有缺失內(nèi)部殘基。針對(duì)每個(gè) 單克隆抗體得到的最好的模型被用作環(huán)精化程序(L00PER,Discovery Studio，Accelrys Inc.，San Diego,USA)的基礎(chǔ)(84)。反過來，從環(huán)精化中選擇五個(gè)最有可能的方案，用作每 個(gè)單克隆抗體的結(jié)構(gòu)集合。從這些同源物模型集合通過計(jì)算提取了參數(shù)(表2)。參數(shù)"下一 個(gè)不同的N端二級(jí)結(jié)構(gòu)"、"下一個(gè)不同的C-端二級(jí)結(jié)構(gòu)"和"卷曲中的位置"是使用Pipeline Pilot(Accelrys Inc.，San Diego,USA)中執(zhí)行的Boolean規(guī)則從周圍殘基的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息 中推導(dǎo)而來。術(shù)語"c-端氨基酸殘基的大小"是指以Λ2計(jì)的溶劑可及表面積(SASA，85)，定 義如下：厶1&，64.78;〇78,95.24;厶8口，110.21;6111，143.92 ;?116，186.7;617,23.13;把8， 146.45；Ile,151.24；Lys,177.37；Leu,139.52；Met,164.67；Asn,113.19；Pro,111.53；Gln, 147.86 ;Arg，210.02;Ser，81.22;Thr，111.6;Val，124.24 ;Trp，229.62;Tyr，200.31<^49C- 端氨基酸殘基具有小于111人2的SASA。大的C-端氨基酸殘基有ΙΙ?Λ2或以上的SASA。
[0141] 對(duì)于每條多肽鏈，抗體的氨基酸序列從N-端到C-端給出。在氨基酸序列中每個(gè)氨 基酸殘基(除了 N-端氨基酸殘基)均具有在前氨基酸殘基。該在前氨基酸殘基位于所討論的 氨基酸殘基的N-端。另外在氨基酸序列中每個(gè)氨基酸殘基(除了 C-端氨基酸殘基)均具有后 續(xù)的氨基酸殘基。此后續(xù)氨基酸殘基位于所討論的氨基酸殘基的C-端。因此，術(shù)語"C-端氨 基酸殘基"是指在氨基酸序列中直接位于所討論的Asn或Asp殘基的C-端的氨基酸殘基，即， 具有N-端酰胺鍵鍵接至該相應(yīng)Asn或Asp殘基的氨基酸殘基。
[0142] 術(shù)語Fv區(qū)表示一對(duì)關(guān)連抗體輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和抗體重鏈可變域。
[0143] 術(shù)語"羧基端二級(jí)結(jié)構(gòu)改變"表示從第一二級(jí)結(jié)構(gòu)至不同的第二二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變。 術(shù)語"二級(jí)結(jié)構(gòu)"指二級(jí)結(jié)構(gòu)（α-)螺旋（helix)、（β_)片層（sheet)、轉(zhuǎn)角（turn)和卷曲 (coil)。因此，二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變是例如從螺旋至片層、轉(zhuǎn)角或卷曲之一的改變，或從片層至 螺旋、轉(zhuǎn)角或卷曲的改變，或從卷曲至螺旋、片層或轉(zhuǎn)角的改變。
[0144] 抗體降解位點(diǎn)和速率的實(shí)驗(yàn)調(diào)查
[0145] 調(diào)查37個(gè)不同的治療性IgGl和IgG4單克隆抗體的集合(表1)。
[0146] 表1:實(shí)驗(yàn)的Asn和Asp熱點(diǎn)集合。主要的修飾以粗體表示。37個(gè)分析的單克隆抗體 中15個(gè)在⑶R之一中包含至少一個(gè)Asn/Asp熱點(diǎn)。
[0147]
[0148] iD =異構(gòu)化，sue =琥泊酰亞胺，dea =脫酰胺
[0149] *只有Asp為脫酰胺物
[0150] t因?yàn)榕c未被同源物模型表示的⑶R糖基化位點(diǎn)的相互作用，從熱點(diǎn)數(shù)據(jù)集中排 除
[0151] #用現(xiàn)有方法(胰蛋白酶消化肽段，AspN肽，CID片段化，Η⑶片段化)證實(shí)修飾位點(diǎn) 是不可能的
[0152] 這些抗體在6.0的典型制劑pH下、在40°C接受了持續(xù)2周的受控?zé)崦{迫（脅迫樣 品），隨后通過質(zhì)譜分析法分析了降解事件，其在脅迫的和相應(yīng)的參考樣本中定位了受影響 的殘基并定量了修飾的量。
[0153] 在37個(gè)單克隆抗體Fv區(qū)的所有559個(gè)Asn和Asp殘基中，60個(gè)殘基（11%)表現(xiàn)出可 定量的修飾的量。這些殘基被細(xì)分為19個(gè)熱點(diǎn)，13個(gè)弱點(diǎn)和28反應(yīng)性點(diǎn)。術(shù)語熱點(diǎn)對(duì)應(yīng)于脅 迫樣本中3%或以上的修飾、術(shù)語弱點(diǎn)對(duì)應(yīng)于1 %至最多不超過3 %的修飾、術(shù)語反應(yīng)性點(diǎn)對(duì) 應(yīng)于少于1 %的修飾。
[0154] 降解位點(diǎn)的位置
[0155] 已發(fā)現(xiàn)，具有3%或更多修飾的降解熱點(diǎn)位于⑶R環(huán)中（見表1)。大多數(shù)熱點(diǎn)位于輕 鏈⑶R1和重鏈⑶R3中，而重鏈⑶R1不包含任何熱點(diǎn)。37個(gè)分析的單克隆抗體中15個(gè)在⑶R之 一中含有至少一個(gè) Asn/Asp熱點(diǎn)。在單克隆抗體 mAb3、mAb4、mAb9、mAblO、mAbl2、mAbl6、 111八1318、11^1319、11^匕21、11^匕27、11^匕28、11^匕29、11^匕31、11^匕33、136￥&。12111]1&13(貝伐單抗）、 Cetuximab(西妥昔單抗）、Adalimumab(阿達(dá)木單抗）、Denosumab(德尼單抗）、Efalizumab (依法珠單抗）、Basiliximab (巴利昔單抗）、Pavilizumab和Panitumab單抗的Fv區(qū)沒有觀察 到熱點(diǎn)。
[0156] 如本文報(bào)道的所有方面的一個(gè)實(shí)施方案是，確定輕鏈CDR1或/和重鏈CDR3中脫酰 胺/異構(gòu)化/琥珀酰亞胺形成(或Asn/Asp降解)熱點(diǎn)的方法。
[0157] 在以往的研究中證明，Asn和Asp的后續(xù)氨基酸殘基影響蛋白質(zhì)中的琥珀酰亞胺形 成速率(40,51)。迄今為止，已經(jīng)描述了八個(gè)不同的序列基序參與治療性抗體Fv區(qū)內(nèi)的化學(xué) 降解(Asn后接Gly，Ser或Thr，和Asp后接Gly，Ser，Thr，Asp或His) (10-14，35，46，65-73)。與 以往的觀察一致，Asn-Gly和Asp-Gly基序是目前為止最容易發(fā)生修飾的，分別對(duì)應(yīng)于⑶R基 序內(nèi)67%和36%的熱點(diǎn)（圖2)。
[0158]降解位點(diǎn)結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)分析
[0159] 抗體Fv片段中所有Asn和Asp殘基（即降解和非降解）的結(jié)構(gòu)環(huán)境用降解機(jī)制中具 有推定作用的一組20個(gè)參數(shù)來表征。使用最新同源物建模軟件生成了 Fab片段的同源物模 型，并根據(jù)建模得分評(píng)估從程序得到的方案。用自動(dòng)化程序從同源物模型在硅片上