檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于化學(xué)分析和生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種信號(hào)放大的高靈敏水環(huán) 境中Hg2+檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 汞在自然界中主要以單質(zhì)和化合物的狀態(tài)存在。單質(zhì)汞即元素汞亦稱為金屬汞。 汞的化合物又可分為有機(jī)汞化合物和無(wú)機(jī)汞化合物兩大類。
[0003] 金屬汞中毒常以汞蒸氣的形式引起。由于汞蒸氣具有高度的擴(kuò)散性和較大的脂溶 性，通過(guò)呼吸道進(jìn)入肺泡，經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)至全身。血液中的金屬汞進(jìn)入腦組織后，被氧化成 汞離子，逐漸在腦組織中積累，達(dá)到一定的量，就會(huì)對(duì)腦組織造成損害。另外一部分汞離子 轉(zhuǎn)移到腎臟。甲基汞在人體腸道內(nèi)極易被吸收并分布到全身，大部分蓄積到肝和腎中，分布 于腦組織中的甲基汞約占15%，但腦組織受損害的則先于其它各組織，主要損害部位為大 腦皮層、小腦和末梢神經(jīng)。因此，甲基汞中毒主要為神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。日本著名的公害病一一 水俁病即為甲基汞慢性中毒。
[0004] 萊離子(Hg2+)是無(wú)機(jī)萊存在的最常見和最穩(wěn)定的形式之一，由于其具有良好的水 溶性和生物累積性，因而對(duì)水生生物以及人類健康具有嚴(yán)重的危害。為了防止汞中毒事件 發(fā)生，《中華人民共和國(guó)環(huán)境保護(hù)法》所制定的生活飲用水和農(nóng)田灌溉水的水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中都規(guī) 定萊含量不得超過(guò)〇. 〇〇lmg/L。
[0005] 目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多靈敏度和特異性較好的Hg2+檢測(cè)方法逐漸運(yùn)用到實(shí)踐中。 傳統(tǒng)的Hg2+檢測(cè)方法主要有原子(吸收、發(fā)射、熒光)光譜法、高效液相色譜法及電感耦合等 離子質(zhì)譜儀等。盡管這些檢測(cè)方法能夠得到比較精確的檢測(cè)結(jié)果，但這些方法依賴大型儀 器設(shè)備、耗費(fèi)耗時(shí)、需進(jìn)行樣品預(yù)處理，且需要專門的技術(shù)人員進(jìn)行操作，檢測(cè)成本高，很難 滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。
[0006] 近年來(lái)研究表明，Hg2+能特異性地與兩個(gè)胸腺嘧啶堿基(T)結(jié)合形成穩(wěn)定的T-Hg2 +-T結(jié)構(gòu)。基于Hg2+的這一特殊性質(zhì)，已經(jīng)發(fā)展了多種Hg2+檢測(cè)方法，如熒光分析法、電化學(xué)分 析法和比色法等。其中，電化學(xué)分析法具有靈敏度高、響應(yīng)速度快等優(yōu)勢(shì)，但是存在檢測(cè)方 法容易受到環(huán)境介質(zhì)等因素的干擾以及信號(hào)穩(wěn)定性較差等問(wèn)題；比色法操作簡(jiǎn)單、不需要 大型儀器設(shè)備，但是其靈敏度較低。熒光分析法由于能夠很好的解決信號(hào)干擾以及具有良 好的選擇性和靈敏度等特性，近年來(lái)受到了研究者的親睞。傳統(tǒng)的熒光分析法由于采用的 是具有短壽命熒光性質(zhì)的染料，因而在檢測(cè)應(yīng)用中容易受到檢測(cè)體系本身熒光以及生物體 內(nèi)源熒光的干擾，使得檢測(cè)方法的背景信號(hào)偏高，影響檢測(cè)方法的信噪比。因此，目前而言， 發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性和特異性好的環(huán)境水體中Hg 2+的檢測(cè)方法是必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了能夠有效地降低在環(huán)境水體中Hg2+含量檢測(cè)中存在的檢測(cè)信號(hào)易受干擾、信 號(hào)不穩(wěn)定以及背景信號(hào)強(qiáng)等問(wèn)題，并提高檢測(cè)信號(hào)的可辨識(shí)度與穩(wěn)定性，本發(fā)明的目的在 于提供一種基于滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)和磁性Fe3〇4納米顆粒的Hg2+含量檢測(cè)方法。通過(guò)本發(fā)明方 法，實(shí)現(xiàn)了緩沖液以及實(shí)際環(huán)境水體樣本Hg2+含量的簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定和特異性的檢測(cè)。
[0008] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0009] -種信號(hào)放大的高靈敏水環(huán)境中Hg2+檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0010] (1)合成氨基修飾磁性Fe3〇4納米顆粒NH2-Fe 3〇4，配制NH2-Fe3〇4溶液；
[0011] (2)捕獲探針H1修飾NH2-Fe3〇4,配制Hl-Fe 3〇4納米顆粒溶液；
[0012] ⑶配制不同濃度Hg2+的溶液；
[0013] ⑷緩沖液中Hg2+含量檢測(cè)；
[0014] (5)準(zhǔn)備待測(cè)環(huán)境水體樣本；
[0015] (6)標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)待測(cè)環(huán)境水體樣本中Hg2+含量。
[0016]優(yōu)選的，所述步驟（1)的具體步驟如下:將2.0質(zhì)量份FeCl3 · 6H20、14.0質(zhì)量份1，6_ 己二胺及4.0質(zhì)量份無(wú)水醋酸鈉溶解于60體積份乙二醇中形成混合溶液;然后將混合溶液 在55°C條件下攪拌完全溶解形成透明溶液;隨后將透明溶液轉(zhuǎn)移到高壓反應(yīng)釜中，200°C反 應(yīng)6. Oh;反應(yīng)結(jié)束后將得到的產(chǎn)物（即氨基修飾磁性Fe3〇4納米顆粒NH2-Fe3〇4)用超純水和無(wú) 水乙醇清洗以完全去除多余的溶劑與反應(yīng)材料;最后將NH 2-Fe3〇4分散于超純水中，4.0°C保 存待用。
[0017] 更優(yōu)選的，所述FeCl3 · 6H20、1，6-己二胺、無(wú)水醋酸鈉、乙二醇、無(wú)水乙醇均為分析 純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
[0018] 更優(yōu)選的，所述攪拌為機(jī)械攪拌，轉(zhuǎn)速約為600rpm/min;所述高壓反應(yīng)釜為不銹鋼 內(nèi)襯聚四氟乙烯反應(yīng)釜（內(nèi)襯容積為l〇〇mL)。
[0019] 優(yōu)選的，所述步驟(2)的具體步驟如下：取5.0體積份用PBS緩沖液分散的、濃度為 0.02mg/mL的NH2-Fe 3〇4溶液，與2.0體積份用PBS緩沖液稀釋配制的體積分?jǐn)?shù)為2.5 %的戊二 醛溶液，室溫(25°C~28°C)劇烈震蕩反應(yīng)3. Oh，使納米顆粒表面醛基修飾，即形成CH〇-Fe3〇4 納米顆粒;將CH〇-Fe3〇4納米顆粒磁性分離并用roS緩沖液洗滌去除多余的戊二醛;隨后重新 分散于5.0體積份PBS緩沖液中，并將0.02體積份濃度為1.0 X l(T5m〇l/L的捕獲探針H1加入 其中，震蕩反應(yīng)3.Oh;反應(yīng)完畢后，加入0.2體積份濃度為1.0 X ΙθΛιοΙ/L的硼氫化鈉溶液氧 化封閉未反應(yīng)的醛基;磁性分離、PBS緩沖液清洗，所得捕獲探針H1修飾Fe3〇 4納米顆粒（即 Hl-Fe3〇4納米顆粒)最終分散于PBS緩沖液(pH=8.0)中于4.0°C保存待用。
[0020] 更優(yōu)選的，所述PBS緩沖液的pH值為8.0,由Na2HP〇4、NaH 2P〇4和NaCl配制而成。
[0021]優(yōu)選的，步驟（3)所述的不同濃度Hg2 +的溶液的配制：稱取0.01713質(zhì)量份Hg (n〇3)2 · H20,加入1.0體積份硝酸溶液(硝酸溶液中硝酸與水的體積比=1:1)，加少量水溶 解，移入1000mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，混勻，得到濃度為5.0 X ΙθΛιοΙ/L的Hg2+溶液并 貯存在密閉的玻璃瓶中。不同濃度Hg2+的溶液由此溶液稀釋而來(lái)。
[0022] 更優(yōu)選的，所述不同濃度Hg2+的溶液濃度分別為：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 7·0、8·0、9·0、10·0、15·0nmol/L〇
[0023]優(yōu)選的，步驟(4)所述緩沖液中Hg2+含量檢測(cè)的具體步驟為:準(zhǔn)備一系列離心管，分 別加入0.02體積份不同濃度Hg2+溶液、0.01體積份1. Oymol/L信號(hào)探針H2、H3，以及2.0體積 份Hl-Fe3〇4納米顆粒溶液;上述混合溶液室溫(25°C~28°C)反應(yīng)20.0 min，隨后磁性分離去 除上清液，PBS緩沖液洗滌去除未反應(yīng)物質(zhì);洗滌完畢后，磁性納米顆粒體系懸浮液加熱到 95°C后迅速在冰水混合物中冷卻以有效釋放信號(hào)探針H2和H3;最后磁性分離，測(cè)定上清液 熒光強(qiáng)度變化以對(duì)Hg2+進(jìn)行定量分析。
[0024] 更優(yōu)選的，所述信號(hào)探針H2和H3均為FAM修飾，所述FAM為5-羥基熒光素，!12為3端 修飾FAM，H3為5端修飾FAMAAM的最大激發(fā)波長(zhǎng)約為492~493nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)約為518~ 520nm〇
[0025] 更優(yōu)選的，所述上清液熒光強(qiáng)度的測(cè)定儀器為Perkin-Elmer LS-55熒光磷光分光 光度計(jì)，設(shè)定參數(shù)分別為最大激發(fā)波長(zhǎng)493nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)520nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫10nm。 所述上清液熒光強(qiáng)度變化具體為：隨著Hg2+含量從0到15 . Onmol/L逐漸升高，熒光強(qiáng)度從 20.0逐漸升高到149.5。
[0026]更優(yōu)選的，所述Hg2+含量測(cè)定過(guò)程中，Hg2+含量在1.0~6.Onmol/L時(shí)與熒光強(qiáng)度呈 現(xiàn)良好的線性關(guān)系。
[0027] 優(yōu)選的，步驟(5)所述待測(cè)環(huán)境水體樣本為:河水、飲用水或自來(lái)水樣本。環(huán)境水體 樣本先用定量濾紙過(guò)濾，然后在高速離心機(jī)（12000rpm/min，10min)上離心去除可見的懸浮 物。
[0028] 優(yōu)選的，步驟(6)所述標(biāo)準(zhǔn)加入法檢測(cè)待測(cè)環(huán)境水體樣本中Hg2+含量步驟與步驟 (4)一致，只是將步驟(4)中不同濃度Hg2+的溶液換為加入標(biāo)準(zhǔn)濃度Hg2+的待測(cè)環(huán)境水體樣 本;所用儀器及參數(shù)與步驟(4) 一致。
[0029] 更優(yōu)選的，所述加入的標(biāo)準(zhǔn)濃度Hg2+濃度分別為2.0、4.0、6. Onmol/L。
[0030] 本發(fā)明最終可以通過(guò)回收率來(lái)考察檢測(cè)方法的可行性，所述回收率計(jì)算公式為R =[(Cr C2)/C3 ] X 100 % ;其中，R表示回收率，C!表示檢測(cè)方法檢測(cè)到的Hg2+濃度，C2表示環(huán) 境水體樣本中的初始Hg 2+濃度，C3表