0X濃縮洗液：KH2PO44.8g， 船2冊〇4-12出0 72.56邑，船(：1160邑，1((：14邑，去離子水80〇1^，調抑值至7.4，添加去離子水 至1L，在此溶液中添加5mLTween-20。使用時按照1:19 (V/V)稀釋獲得樣品稀釋液。
[0046] b)包被液（0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH值9.6):每個試劑盒裝量1瓶，250 mL/瓶。Na2C〇3 1.59g，Na肥〇3 2.93g，加去離子水溶解至1L。
[0047] C)TMB底物顯色液購自天根公司，每個試劑盒裝量1瓶/盒，50mL。
[0048] d)終止液:每個試劑盒裝量1瓶，250mL/瓶;終止液的配制：2mol/L硫酸溶液 化2S化），濃硫酸溶液濃度為18mol/L，濃硫酸與去離子水按1:9配制。
[0049] e)封閉液的配制:脫脂奶粉5g，去離子水100mL。
[0050]f)100mmol/LPBST(pH值7.4)的配制如下：0.26gKH2P04,2.89g化2HP(k-12此0,8.71g化Cl，800ml去離子水，100μΙ硫柳隸，調PH值至7.4，添加無離子水至化，在 此溶液中添加5mLTween-20。
[0051] 6)按照實施例2的包被方法用坦布蘇病毒E蛋白和NSl蛋白包被的酶標板各5 塊。
[0052] 7)組裝:將鴨坦布蘇病毒E重組蛋白包被酶標板、NS1重組蛋白包被酶標板、標準陽 性對照血清、標準陰性對照血清、兔抗鴨酶標二抗、樣品稀釋液、20X濃縮洗液、TMB底物顯 色液和終止液，W及自封袋、使用說明書組裝成試劑盒。
[0053] 實施例4.E-ELISA和NS1-ELISA抗體檢測試劑盒的檢測規(guī)程 A.樣品的稀釋:取待檢測的禽類血清樣品，用樣品稀釋液稀釋100倍。
[0054] B.分別加入10化L的標準陽性、陰性對照血清及100倍稀釋的被檢血清樣品，每種 血清樣品Ξ個重復孔。
[00巧]C.蓋上保鮮膜，37°C作用化。
[0056]D.去膜，用2(Κ)化的IX洗液洗3遍，每次5m，并將化ISA板中的液體拍干。
[0057] E.在每個反應孔中加入10化1的酶標二抗（HRP標記的兔抗鴨二抗）。
[005引F.蓋上膜，37°C作用化。
[0059] G.去膜，用2(Κ)化的IX洗液洗3遍，每次5m，并將化ISA板中的液體拍干。
[0060] H.在每個反應孔中加入1(Κ)化的TMB底物顯色液，在黑暗處作用15min。
[0061] I.在每個反應孔中加入1(Κ)化的終止液。
[0062] J. 5-lOmin內(nèi)，將化ISA板放入酶標儀(FC，購自化ermo)中，在450皿下完成讀 數(shù)，并記錄結果。
[0063]K.結果判定:每一樣品Ξ個孔的0D值應基本一致，若測定值差別較大，該酶標板 測定無效。若陽性對照值OD低于或接近標準陰性對照OD值時，測定也無效。E-ELISA時，待ii樣品0D值大于等于0.348時，說明待測樣品為陽性，否則為陰性;NS1-ELISA時，待測樣品 0D值大于等于0.416時，說明待測樣品為陽性，否則為陰性。若E-化ISA檢測陽性而NS1-ELISA檢測陰性時，說明待測血清樣品為滅活疫苗免疫動物血清，若E-化ISA檢測陰性而 NS1-ELISA檢測陽性時，說明待測血清樣品為臨床癥狀出現(xiàn)前的早期感染動物血清，若E-ELISA和NS1-ELISA檢測均陽性時，說明待測血清樣品為野毒自然感染動物血清，若E-ELISA 和NS1 -ELI SA檢測均陰性時，說明待測血清樣品沒有感染坦布蘇病毒。
[0064] 例如，采集自某個鴨場臨床血清139份，按照本發(fā)明的E-化ISA和NS1-化ISA的操 作步驟進行檢測，結果E-Elisa和NS1-ELISA同時檢測陽性血清樣品129份，為野毒自然感染 動物血清；同時檢測陰性血清樣品7份，為未感染坦布蘇病毒的動物血清;NS1-E1 isa檢測陽 性而E-ELISA檢測陰性的待測血清樣品3份，為臨床癥狀出現(xiàn)前的早期感染動物血清。
[0065] L.特異性檢驗:對禽細小病毒、禽流感病毒、新城疫病毒、禽呼腸孤病毒、I型鴨 肝炎病毒、鴨攝病毒陽性血清檢測均呈陰性反應，說明本發(fā)明的試劑盒能夠特異性檢測鴨 坦布蘇病毒。
[0066]



【主權項】
1. 一種鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑盒，其特征在 于，包括：鴨坦布蘇病毒E重組蛋白包被酶標板、NS1重組蛋白包被酶標板、標準陽性對照血 清、標準陰性對照血清、兔抗鴨酶標二抗、樣品稀釋液、濃縮洗液、TMB底物顯色液和終止液。2. 如權利要求1所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑 盒，其特征在于:所述鴨坦布蘇病毒E重組蛋白包被酶標板通過用在原核表達系統(tǒng)中重組表 達的鴨坦布蘇病毒E蛋白包被ELISA板制得;所述NS1重組蛋白包被酶標板通過用在原核表 達系統(tǒng)中重組表達的鴨坦布蘇病毒NS1蛋白包被ELISA板制得。3. 如權利要求1或2所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試 劑盒，其特征在于:所述標準陽性對照血清為鴨坦布蘇病毒滅活疫苗免疫若干次SPF鴨后分 離得到的鴨血清。4. 如權利要求3所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑 盒，其特征在于:所述標準陰性對照血清為未感染鴨坦布蘇病毒的鴨血清。5. 如權利要求1所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑 盒，其特征在于:所述兔抗鴨酶標二抗為HRP標記的兔抗鴨二抗。6. 如權利要求1所述鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑 盒的檢測方法，其特征在于，包括步驟： 1)將待測鴨血清樣品、標準陽性對照血清和標準陰性對照血清分別加入所述鴨坦布蘇 病毒E重組蛋白包被酶標板和NS1重組蛋白包被酶標板的獨立孔中，37°C反應l_3h后，4°C過 夜； 2 )將每孔洗滌后，分別加入所述兔抗鴨酶標二抗，37°C反應0.5-2h; 3 )將每孔洗滌后，分別加入TMB底物顯色液進行顯色反應； 4) 加入終止液，終止顯色反應，在酶標儀上讀數(shù)； 5) 判斷:E-ELISA待測樣品0D值大于等于0.348時，待測樣品為陽性，否則為陰性;NS1-ELISA待測樣品0D值大于等于0.416時，待測樣品為陽性，否則為陰性;若E-ELISA檢測陽性 而NS1-ELISA檢測陰性，明待測血清樣品為滅活疫苗免疫動物血清;若E-ELISA檢測陰性而 NS1-ELISA檢測陽性，待測血清樣品為臨床癥狀出現(xiàn)前的早期感染動物血清;若E-ELISA和 NS1-ELISA檢測均陽性，待測血清樣品為野毒自然感染動物血清;若E-ELISA和NS1-ELISA檢 測均陰性，待測血清樣品沒有感染坦布蘇病毒。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒別鴨坦布蘇病毒感染動物和滅活苗免疫動物的ELISA檢測試劑盒及其檢測方法，屬于檢測試劑盒領域。本發(fā)明的試劑盒包括：鴨坦布蘇病毒E重組蛋白包被酶標板、NS1重組蛋白包被酶標板、標準陽性對照血清、標準陰性對照血清、兔抗鴨酶標二抗、樣品稀釋液、濃縮洗液、TMB底物顯色液和終止液?？蓪游镅逯械奶共继K病毒感染情況進行早期診斷，可做到早發(fā)現(xiàn)、早防控。同時使用E-ELISA和NS1-ELISA檢測方法進行血清學調查，即可區(qū)別野毒感染動物和滅活疫苗免疫動物，根據(jù)血清學調查結果制定相應的防控策略，通過淘汰或診治，逐步減少野毒感染動物數(shù)量，達到最終凈化該病的目的。
【IPC分類】G01N33/569
【公開號】CN105445458
【申請?zhí)枴緾N201510776242
【發(fā)明人】呂素芳, 郭廣君, 沈志強, 李峰, 祖立闖, 董炳梅
【申請人】山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2015年11月13日