專利名稱：雞新城疫濃縮滅活苗的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種疫苗的生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)，具體地說(shuō)，是一種雞新 城疫濃縮滅活苗濃縮技術(shù)的改進(jìn)方法。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
新城疫病毒(Newcastlediseasevirus， NDV)又稱亞洲雞瘟病毒、偽雞 瘟病毒或禽肺腦炎病毒。在病毒分類學(xué)中的位置屬于副黏病毒科 (Paramyxoviridae)、畐U黍占病毒屬(Paramyxovirus)中的一個(gè)禾中。該病毒主 要危害雞、珠雞和火雞，在被侵襲的雞群中迅速傳播，強(qiáng)毒株可使雞群全 群毀滅。弱毒株僅引起雞群呼吸道感染和產(chǎn)蛋量下降，但可迅速康復(fù)。人 類可因接觸病禽和活毒疫苗而引起結(jié)膜炎或淋巴腺炎，但很快便康復(fù)。新 城疫病毒被OIE規(guī)定為A類疫病，是一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病 率和死亡率都在90%以上，1935年梁英、馬聞天等首次證實(shí)我國(guó)有該病的 流行[l]，現(xiàn)在本病被我國(guó)列為I類疫病。
新城疫病毒是ssRNA病毒，有包膜。病毒顆粒具多形性，有圓形、橢 圓形和長(zhǎng)桿狀等。成熟的病毒粒子直徑100 400mn。包膜為雙層結(jié)構(gòu)膜， 由宿主細(xì)胞外膜的脂類與病毒糖蛋白結(jié)合衍生而來(lái)。包膜表面有長(zhǎng)12 15mn的刺突，具有血凝素、神經(jīng)氨酸酶和溶血素。病毒的中心是ssRNA分 子與附在其上的蛋白質(zhì)衣殼粒，纏繞成螺旋對(duì)稱的核衣殼，直徑約18nm。 成熟的病毒是以出芽方式釋放至細(xì)胞外。
新城疫病毒對(duì)外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，55'C作用45min和直射陽(yáng)光下 作用30min才被滅活。病毒在4X:中存放幾周，在-20。C中存放幾個(gè)月或在 -7(TC中存放幾年，其感染力均不受影響。在新城疫暴發(fā)后8周之內(nèi)，仍可 在雞舍、蛋巢、蛋殼和羽毛中分離到病毒。病毒對(duì)乙醚敏感。大多數(shù)去污劑能將它迅速滅活。氫氧化鈉等堿性物
質(zhì)對(duì)它的消毒效果不穩(wěn)定。3% 5%來(lái)蘇爾、酚和甲酚5min內(nèi)可將裸露的 病毒粒子滅活。在37X:的孵卵器內(nèi)，用O. 1X福爾馬林熏蒸6h便可把它滅 活。
新城疫病毒的所有毒株都能凝集多種禽類和哺乳類動(dòng)物的紅細(xì)胞。大 多數(shù)毒株能凝集公牛和綿羊的紅細(xì)胞。在病毒的血凝試驗(yàn)中，雞的紅細(xì)胞 最為常用。
該病毒可在9 12日齡的雞胚絨毛尿囊膜上和尿囊腔中培養(yǎng)，大多數(shù)毒株 也可在兔、豬、犢牛和猴的腎細(xì)胞以及雞組織細(xì)胞等繼代或傳代細(xì)胞中培 養(yǎng)。雞胚的成纖維細(xì)胞、雞胚和倉(cāng)鼠的腎細(xì)胞常用于新城疫病毒的培養(yǎng)。
目前，雖然疫苗的使用使該病得到了有效控制,但由于疫苗免疫效果不 理想，以及流行毒株的毒力增強(qiáng)和我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)水平的參差不齊，使得該病 仍然是嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)的疾病之一，在我國(guó)經(jīng)常有非典型新城疫的發(fā) 生，甚至典型新城疫的爆發(fā)。
當(dāng)前，防制該病所用的疫苗主要有活疫苗和滅活疫苗，其中活疫苗有 弱毒疫苗II系、III系、IV系和中等毒力疫苗I系[2]，弱毒疫苗的缺點(diǎn) 是不能突破母源抗體的干擾，中等毒力疫苗雖能突破母源抗體的影響，能 夠快速的產(chǎn)生抗體，但可引起雞發(fā)病，存在散毒的危險(xiǎn)，據(jù)報(bào)道可引起雞 的非典型新城疫。滅活疫苗主要為油乳劑滅活疫苗，它可以避開母源抗體 的影響，不存在散毒的危險(xiǎn)，適合于任何日齡的雞免疫；但由于目前流行 毒株的毒力增強(qiáng)，使得免疫劑量不斷加大，這給免疫帶來(lái)了不便，并且疫 苗免疫的副反應(yīng)增強(qiáng)，接種部位往往出現(xiàn)吸收不良或肉芽腫，影響了禽類制 品的質(zhì)量，給養(yǎng)禽業(yè)造成了一定的損失。因此，目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)雞業(yè)迫切需求 免疫效果好、免疫劑量小的雞新城疫滅活疫苗，來(lái)解決以上問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種雞新城疫濃縮滅 活苗的制備方法，使其提供副作用小、免疫產(chǎn)生時(shí)間早、免疫力強(qiáng)、免疫 期長(zhǎng)的疫苗。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟:
1) 將雞新城疫病毒弱毒株凍干毒復(fù)溶，連續(xù)傳代接種雞胚9代，分別 凍干保存，作為生產(chǎn)雞新城疫濃縮型滅活疫苗的基礎(chǔ)種毒和生產(chǎn)用種毒；
2) 將病毒液滅活后，使用30KD膜包對(duì)病毒超濾濃縮5倍；
3) 在高壓乳化泵中將濃縮后的水相與油相按1: 1比例混合乳化，即 成雞新城疫濃縮滅活疫苗，滅活前的病毒含量>106. 3EID50/0. lml。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，雞新城疫病毒弱毒株優(yōu)選是LaSota，效檢用 強(qiáng)毒優(yōu)選是雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCCAV1611株)，均為現(xiàn)行《中華人 民共和國(guó)獸藥典》中"雞新城疫滅活疫苗"的生產(chǎn)和檢驗(yàn)用毒種，購(gòu)自中 國(guó)獸藥監(jiān)察所。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述的30KD膜購(gòu)自Millipore公司。 在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，在實(shí)施步驟3之前還可在滅活毒液中加入 無(wú)菌5%吐溫-80，為水相；在10號(hào)白油中加入6%司本-80，再加入2%硬脂 酸鋁，滅菌后為油相。
本發(fā)明的基本原理是，滅活苗的免疫效果除受病毒或毒株本身的影響 外，主要取決于滅活苗的劑型和抗原含量。就病毒性滅活疫苗的劑型來(lái)講， 目前看來(lái)油乳劑滅活苗的效果最為確實(shí)；就抗原含量來(lái)講，為確保單位容 積疫苗內(nèi)抗原含量，開始使用抗原濃縮技術(shù)。目前通用的抗原濃縮技術(shù)主 要有濃縮膠濃縮法、沉淀濃縮法、離心濃縮法、透析濃縮法、冷凍干燥法、 層析濃縮法和過濾濃縮法。由于過濾濃縮法具有成本低，過濾膜能反復(fù)使 用，過濾量大，同時(shí)對(duì)抗原成份能進(jìn)行一定程度的純化等優(yōu)點(diǎn)，已被國(guó)內(nèi)外的研究和生產(chǎn)者普遍采用，其中用Milipore超濾膜濃縮法(Miliporee 超濾濃縮機(jī)30KD的濃縮膜及其配件，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司)已在國(guó)外 很多生產(chǎn)廠家投入生產(chǎn)使用，國(guó)內(nèi)也有不少?gòu)S家在研究使用[3]。發(fā)明人在 查閱大量的相關(guān)文獻(xiàn)和分析從新城疫病毒分子大小的基礎(chǔ)上，引進(jìn)國(guó)外的 先進(jìn)的超濾濃縮技術(shù)，采用截流分子量為30KD的Milipore超濾膜進(jìn)行NDV 雞胚液的濃縮。此技術(shù)可在lh內(nèi)處理數(shù)10L抗原液，為規(guī)?；a(chǎn)提供了 方便。同時(shí)去除了疫苗中的部分雜蛋白被，增加了疫苗中有效抗原的含量， 使得免疫后可以快速的產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，提高了免疫應(yīng)答的效率。
有益效果
本發(fā)明采用標(biāo)準(zhǔn)的雞新城疫毒株，經(jīng)雞胚傳代培養(yǎng)，采用Milipore超 濾膜濃縮法濃縮滅活后制成油乳劑疫苗，試驗(yàn)證明30KD的膜能將病毒胚液 中全部抗原成份截留；
超濾濃縮膜的濃縮效果穩(wěn)定性良好，濃縮后抗原的HA效價(jià)與濃縮倍數(shù) 成正相關(guān)；
生產(chǎn)上對(duì)效價(jià)偏低的胚液可以通過加大濃縮倍數(shù)的方法提高效價(jià)。實(shí) 際生產(chǎn)中可以根據(jù)制品要求通過簡(jiǎn)便快速的HA試驗(yàn)確定濃縮倍數(shù)；
對(duì)滅活疫苗來(lái)講，發(fā)明人用的主要是其抗原成份，而不是活病毒的含 量，因此在對(duì)濃縮后抗原含量測(cè)定時(shí)應(yīng)以檢測(cè)HA效價(jià)為主。并且HA效價(jià) 測(cè)定簡(jiǎn)便、快捷、易行，在生產(chǎn)中也便于實(shí)行；
使用Millipore超濾濃縮膜濃縮抗原，效果好，穩(wěn)定性強(qiáng)，適于一定 規(guī)模的生產(chǎn)使用；
用疫苗免疫雞后10 14天產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，免疫期10個(gè)月，免疫期 內(nèi)攻毒保護(hù)率100%。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例做進(jìn)一步的說(shuō)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明目的， 而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1
雞新城疫病毒弱毒LaSota株作為毒種，接種10日齡SPF雞胚，收獲 接種后72-120小時(shí)死亡且病痕明顯的雞胚液，采用截流分子量為30KD的 Milipore超濾膜進(jìn)行NDV雞胚液的濃縮，濃縮后加入福爾馬林液使含量達(dá) 0.2%。搖勻后37"C滅活16小時(shí)。在滅活前，按部頒標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病毒含量的測(cè) 定，病毒含量〉108.8EID50/0. lml。取滅活病毒液接種于SPF雞胚6個(gè)， 觀察5日，雞胚非特異性死亡不超過1個(gè)。對(duì)所有胚液分別測(cè)定血凝價(jià)， 均不出現(xiàn)血凝時(shí)備用。在滅活毒液中加入無(wú)菌5%吐溫-80，為水相；在10 號(hào)白油中加入6%司本-80，再加入2%硬脂酸鋁，滅菌后為油相。在高壓乳 化泵中將水相和油相按l: l比例混合乳化，即成雞新城疫濃縮滅活苗，病 毒含量〉108. 8EID50/0. lml。
該疫苗經(jīng)性狀測(cè)定和安全性試驗(yàn)表明，為油包水類型，穩(wěn)定性良好， 粘度適中，安全可靠。該疫苗在4"C保存12個(gè)月不出現(xiàn)分層。同時(shí)測(cè)定其 濃縮前和濃縮后的 EID50 從 106. 31EID50/0. lml 升高到 108. 84EID50/0. lml;血凝價(jià)從29上升到211。試驗(yàn)雞接種本疫苗后10 14天產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，免疫期10個(gè)月，免疫期內(nèi)的攻毒保護(hù)率為100%。
實(shí)施例2
雞新城疫病毒弱毒LaSota株接種10日齡SPF雞胚，收獲接種后72-120 小時(shí)死亡且病痕明顯的雞胚液，采用截流分子量為30KD的Milipore超濾 膜進(jìn)行NDV雞胚液的濃縮，濃縮后加入福爾馬林液使含量達(dá)0. 2%。搖勻后37"C滅活16小時(shí)。對(duì)滅活后的病毒液做滅活檢驗(yàn)，滅活完全的毒液備用。 在滅活毒液中加入無(wú)菌5%吐溫-80，為水相；在10號(hào)白油中加入6%司本-80， 再加入2%硬脂酸鋁，滅菌后為油相。在高壓乳化泵中將水相和油相按l: 1 比例混合乳化，即成雞新城疫濃縮滅活苗，病毒含量〉108.8EID50/0. lml。 本苗適用于各養(yǎng)禽場(chǎng)對(duì)禽類的免疫接種，安全可靠。疫苗免疫雞后10 14天產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，免疫期10個(gè)月，免疫期內(nèi)的攻毒保護(hù)率為100%。
權(quán)利要求
1. 一種雞新城疫濃縮滅活苗的生產(chǎn)方法，包括以下步驟1)將雞新城疫病毒弱毒株凍干毒復(fù)溶，連續(xù)傳代接種雞胚9代，分別凍干保存，作為生產(chǎn)雞新城疫濃縮型滅活疫苗的基礎(chǔ)種毒和生產(chǎn)用種毒；2)將病毒液滅活后，使用30KD膜包對(duì)病毒超濾濃縮5倍；3)在高壓乳化泵中將濃縮后的水相與油相按11比例混合乳化，即成雞新城疫濃縮滅活疫苗，滅活前的病毒含量>106.3EID50/0.1ml。
2. 權(quán)利要求1所述的方法，其中在實(shí)施步驟3之前還可在滅活毒液中加入無(wú)菌5%吐溫-80，為水相；在10號(hào)白油中加入6%司本-80，再加入2°/0硬脂酸鋁，滅菌后為油相。
3. 權(quán)利要求1或2所述的方法，其中雞新城疫病毒弱毒株優(yōu)選是LaSota，效檢用強(qiáng)毒優(yōu)選是雞新城疫病毒強(qiáng)毒北京株(CVCCAV1611株)。
全文摘要
本發(fā)明提供一種改進(jìn)的雞新城疫濃縮滅活苗的生產(chǎn)方法，包括病毒接種傳代、超濾濃縮、水相和油相混合等步驟。其中，使用30KD膜進(jìn)行超濾濃縮，并在高壓乳化泵中將濃縮后的水相與油相按1∶1比例混合乳化。由于本發(fā)明利用超濾膜濃縮和抗原成份，而不是活病毒的含量，因此所疫苗免疫雞后10～14天產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)免疫力，免疫期10個(gè)月，免疫期內(nèi)攻毒保護(hù)率100％，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61K39/155GK101474401SQ200810153998
公開日2009年7月8日 申請(qǐng)日期2008年12月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月11日
發(fā)明者楊保收, 蕊 熊 申請(qǐng)人:天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司