一種y形dna組裝結(jié)合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境分析化學領(lǐng)域，涉及一種汞離子檢測方法及檢測試劑盒，尤其涉及一種Y形DNA組裝結(jié)合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]汞離子(Hg2+)對人體健康存在多種危害，能夠在生物體內(nèi)累積，可通過食物鏈轉(zhuǎn)移至人體內(nèi)，具有很強的致癌、致畸、致突變性。人體內(nèi)的累積的微量Hg2+無法通過自身代謝進行排泄，將導致心臟、肝、神經(jīng)系統(tǒng)病變，甚至引起癌變。因此，對Hg2+的高靈敏檢測具有重要意義。傳統(tǒng)的汞離子檢測方法主要有原子吸收光譜法、原子熒光光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等。然而這些技術(shù)通常需要復雜的操作與樣品前處理過程以及昂貴的儀器，嚴重制約了這些檢測方法的應(yīng)用。已報道的一些生物傳感器用于汞離子的檢測往往需要涉及探針標記，或者固定洗滌過程，操作步驟麻煩，檢測靈敏度不夠。因此，開發(fā)一種操作簡單、成本低廉、無需標記、無需分離洗滌的高靈敏汞離子檢測方法和檢測試劑盒具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，建立一種Y形DNA組裝結(jié)合信號擴增用于汞離子的檢測方法及檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種超敏汞或銀離子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系、核酸外切酶III和雙鏈DNA熒光染料，其特征在于:核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中序列A的5’到’ 3端依次為a區(qū)、b區(qū)和通用凸出區(qū)d ;序列B的5’到’ 3端依次為c區(qū)、a*區(qū)和通用凸出區(qū)d ;序列C的5’到’ 3端依次為b*、c*和和通用凸出區(qū)d ;序列D的5’到’ 3端依次為d*區(qū)和保護序列；a、b、c區(qū)分別和a*、b*、c*區(qū)序列互補配對，d*區(qū)和通用凸出區(qū)d互補配對后至少存在一組不配對的T-T對或C-C對；保護序列為不含4個或以上連續(xù)的T或C的隨機序列。
[0005]進一步的，a、b、c區(qū)序列的長度獨立為9?21個堿基。優(yōu)選的，a、b、c區(qū)序列的長度獨立為12?17個堿基。
[0006]d區(qū)序列的長度獨立為9?15個堿基。
[0007]序列D的保護序列至少具有6個堿基。
[0008]d*區(qū)和通用凸出區(qū)d互補配對后存在2?6組不配對的T-T對或C-C對。
[0009]緩沖體系不與待測離子反應(yīng)生成沉淀。
[0010]雙鏈DNA 熒光染料選自 SYBR Green 1、EB、Gene finder ο
[0011]—種超敏汞或銀離子檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列A、B、C于緩沖體系混合，使其相互雜交形成Y形復合體，加入雙鏈DNA熒光染料；
2)在緩沖體系中繼續(xù)加入核酸序列D、核酸外切酶III和待測樣品，繼續(xù)反應(yīng)； 3)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定汞離子的濃度；
其中，核酸序列A?D的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:
1)以形成的Y形DNA為傳感檢測平臺，只需簡單雜交即可完成反應(yīng)，操作簡單，價格低廉。
[0013]2)無需標記修飾，無需分離洗滌過程，方便快速檢測。
[0014]3)以核酸外切酶擴增信號，檢測靈敏度高，選擇性好。
[0015]本發(fā)明方法對汞的檢測限為5pM，線性范圍從ΙΟρΜ?ΙΟΟηΜ，線性范圍大。
【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明的檢測原理示意圖；
圖2為對不同濃度的Hg2+檢測的結(jié)果圖；
圖3為特異性實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0017]一種超敏汞或銀離子檢測試劑盒，包括核酸序列、緩沖體系、核酸外切酶III和雙鏈DNA熒光染料，核酸序列由核酸序列A、B、C、D組成，其中序列A的5’到’ 3端依次為a區(qū)、b區(qū)和通用凸出區(qū)d ;序列B的5’到’ 3端依次為c區(qū)、a*區(qū)和通用凸出區(qū)d ;序列C的5’到，3端依次為b*、c*和和通用凸出區(qū)d ;序列D的5’到’ 3端依次為d*區(qū)和保護序列；a、b、c區(qū)分別和a*、b*、c*區(qū)序列互補配對，d*區(qū)和通用凸出區(qū)d互補配對后至少存在一組不配對的T-T對或C-C對；根據(jù)檢測離子的不同，保護序列為不含4個或以上連續(xù)的T (檢測汞離子時)或C (檢測銀離子時)的隨機序列。
[0018]進一步的，a、b、c區(qū)序列的長度獨立為9?21個堿基。優(yōu)選的，a、b、c區(qū)序列的長度獨立為12?17個堿基。d區(qū)序列的長度獨立為9?15個堿基。
[0019]這是因為上述區(qū)域的序列過短，則形成的Y型DNA復合體不夠穩(wěn)定，且與雙鏈DNA熒光染料反應(yīng)產(chǎn)生的熒光比較弱，不利于檢測；而序列過長則可能形成二級結(jié)構(gòu)，不利于核酸外切酶III的切割，對離子的檢測效果都有不利的影響。
[0020]序列D的保護序列至少具有6個堿基。該保護序列同時不與a、b、c區(qū)或a*、b*、c*區(qū)的序列互補。從合成簡便性考慮，保護序列可以是6個或更多個連續(xù)A。
[0021]d*區(qū)和通用凸出區(qū)d互補配對后存在2?6組不配對的T-T對或C-C對。
[0022]緩沖體系不與待測離子反應(yīng)生成沉淀。
[0023]雙鏈DNA 熒光染料選自 SYBR Green 1、EB、Gene finder ο
[0024]一種超敏汞或銀離子檢測方法，包括如下步驟:
1)將核酸序列A、B、C于緩沖體系混合，使其相互雜交形成Y形復合體，加入雙鏈DNA熒光染料；
2)在緩沖體系中繼續(xù)加入核酸序列D、核酸外切酶III和待測樣品，繼續(xù)反應(yīng)；
3)根據(jù)反應(yīng)體系的熒光值變化情況確定汞離子的濃度；
其中，核酸序列A?D的結(jié)構(gòu)如上所述。
[0025]以汞離子的檢測為例，本發(fā)明的檢測原理如圖1所示。
[0026]將核酸序列A、B、C于緩沖體系混勻，核酸序列A、B、C相互配對形成A_B_C Y形DNA復合體。在Y形DNA復合體中，各個3’都端凸起；該Y形DNA復合體存在雙鏈，與雙鏈DNA熒光染料(如SYBR Green)反應(yīng)會產(chǎn)生較強的熒光；
加入核酸序列D，D與Y形DNA的凸起互補，除了 T-T堿基不配對，如反應(yīng)體系中存在汞離子(Hg2+)，在汞離子的作用下，會通過形成T-Hg2+-T復合物，使D結(jié)合在Y形DNA上，D的30端凸起；如反應(yīng)體系中不存在萊離子，則D不能與Y形DNA的凸起互；
加入核酸外切酶III，核酸外切酶III能從雙鏈DNA的30端開始切割DNA，從而把Y形DNA切