一種分析動物性食品中四類29種限用獸藥殘留的uplc-ms/ms方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于動物性食品中獸藥殘留的測定技術(shù)領(lǐng)域，涉及雞肉、雞肝、豬肉和豬肝 樣品中四環(huán)素類、金剛烷胺、磺胺類和喹諾酮類四類共29種限用獸藥殘留是否超標的測定 方法，特別是，采用改進的QuEChERS方法作為測定前的處理方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 獸藥殘留是指給動物使用藥物后積蓄或貯存在動物細胞、組織或器官內(nèi)的藥物原 形、代謝產(chǎn)物和藥物雜質(zhì)。獸藥殘留主要是由于不合理使用藥物治療動物疾病和作為飼料 添加劑而引起。我國雖已制定《動物性食品中獸藥最高殘留限量》以及《飼料藥物添加劑使 用規(guī)范》，但目前養(yǎng)殖業(yè)中非法使用違禁獸藥，濫用抗菌藥和飼料添加劑的問題普遍存在， 從而導致獸藥在動物性食品中的殘留事件時有發(fā)生，嚴重威脅著人們的生命安全，同時嚴 重影響我國動物性食品出口貿(mào)易。
[0003] 金剛烷胺、磺胺類、喹諾酮類和四環(huán)素類獸藥是獸醫(yī)臨床上最常用且易被濫用的 藥物，農(nóng)業(yè)部對上述獸藥也制定了最大殘留限量（MRLs值）規(guī)定。近幾年，隨著食品安全問 題日益被重視，食品檢驗機構(gòu)面臨大量的檢測工作。目前檢測方法仍以單類獸藥的檢測為 主，因此，樣品需要重復處理，分別檢測，耗時費力。實現(xiàn)多類獸藥同時檢測是許多獸藥殘留 分析工作者努力的目標。
[0004] 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高靈敏度和高選擇性的優(yōu)勢，已成為復雜的動物組 織樣品中多類獸藥殘留同步檢測的主流方法。已報道的獸藥多殘留方法有的同時檢測喹諾 酮類和磺胺類獸藥，有的同時檢測四環(huán)素類與喹諾酮類獸藥。但是，由于四環(huán)素類獸藥理 化性質(zhì)特殊，較難與其他多類獸藥同時提取、凈化，因此，尚未見四環(huán)素類與磺胺類、喹諾酮 類、金剛烷胺等獸藥同時檢測的文獻報道。此外，已報道的方法多采用固相萃取柱凈化，檢 測成本也較高。
[0005] QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)方法快速、簡便、成 本低廉、易于操作，已逐步被應(yīng)用于獸藥殘留檢測。本研究借鑒QuEChERS方法的優(yōu)勢，對經(jīng) 典的QuEChERS方法做了改進，解決了四環(huán)素類獸藥難與其他獸藥同步檢測的難題，同時簡 化了操作步驟，節(jié)約了檢測成本，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，建立了雞肉、雞 肝、豬肉和豬肝樣品中四環(huán)素類、金剛烷胺、磺胺類和喹諾酮類四類29種限用獸藥的同步 快速檢測方法。該方法具有高效、快速、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，凈化效果好，靈敏度高，準 確度和精密度均符合多殘留分析方法的要求，適用于各食品檢測機構(gòu)對動物性食品中獸藥 殘留的日常監(jiān)控。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006] 本發(fā)明的目的在于克服四環(huán)素類獸藥難與其他多類獸藥同時處理的難題，同時， 簡化操作步驟，降低檢測成本，公開一種采用改進的QuEChERS方法處理樣品，分析包含四 環(huán)素類在內(nèi)的多類獸藥殘留的UPLC-MS/MS方法。
[0007] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的，本發(fā)明所述的動物性食品中四環(huán)素 類、金剛烷胺、磺胺類和喹諾酮類四類共29種獸藥殘留的測定方法，包括以下步驟：
[0008] a、準確稱取勻漿好的樣品2. OOg (精確至0.0 lg)于50mL聚丙烯塑料離心管中，加 入2mL0. lmol/L Na2EDTA-McIlvaine緩沖液，3mL乙臆，于旋潤混合器上潤旋2min，4000轉(zhuǎn) /min，離心5min，收集提取液于另一 50mL離心管中。
[0009] b、殘漁加入5mL乙腈，于旋潤混合器上潤旋2min，4000轉(zhuǎn)/min,離心5min，合并提 取液。
[0010] C、于提取液中依次加入200 μ L冰乙酸，L Og氯化鈉，于旋渦混合器上渦旋lmin， 4000轉(zhuǎn)/min,離心5min，取2mL乙腈相（上層）于IOmL聚丙烯塑料離心管中。
[0011] d、分別加入 IOOmg C18 和 IOOmg NH2 吸附劑，潤旋 lmin，4000 轉(zhuǎn)/min,離心 5min, 上清液于40°C條件下氮氣吹干，殘渣加 ImL甲醇-0. 1 %甲酸水（10+90, v/v)定容，過 0. 22 μ m有機濾膜，待測。
[0012] e、準備標準工作溶液：分別稱取各標準品適量，磺胺類獸藥用乙腈溶解并定容，金 剛烷胺用1 %甲酸乙腈溶解并定容，喹諾酮類獸藥用〇. 〇3mol/L氫氧化鈉溶液溶解，甲醇定 容，配制成濃度均為100 μ g/mL的標準儲備液，于4°C條件下保存。分別吸取29種獸藥標準 儲備液0. 25mL于25mL容量瓶，用甲醇稀釋并定容，配制成濃度為I. 0 μ g/mL的混合標準工 作液，于4°C條件下保存，可使用一個月。
[0013] f、準備基質(zhì)匹配標準溶液：對空白雞肉樣品按相同前處理方式處理，定容得到空 白樣品基質(zhì)溶液。分別取適量混合標準工作溶液，氮氣吹干，用空白樣品基質(zhì)溶液溶解，配 制濃度為2. 5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL的系列基質(zhì)匹配標準溶液。
[0014] g、采用UPLC-MS/MS法對基質(zhì)匹配標準溶液和供試樣品進行測定，以濃度為橫坐 標，以定量離子的峰面積為縱坐標繪制標準曲線，以線性方程來計算供試樣品中目標獸藥 的殘留量。
[0015] 在UPLC-MS/MS測定時采用的色譜條件為：色譜柱：Acquity? BEH RP18柱 (2. IXlOOmnUJym);流動相：0. 1 %甲酸甲醇-0. 1 %甲酸水；梯度洗脫條件見表1。流速： 0· 2mL/min ;進樣量：10 μ L ;柱溫：30°C。
[0016] 表1梯度洗脫條件
[0018] 采用的質(zhì)譜條件為：電離模式：電噴霧正離子ESI (+);毛細管電壓：3. OKv ;離子 源溫度：11(TC ;脫溶劑氣溫度：380°C ;脫溶劑氣流量：550L/h ;錐孔反吹氣流量：50L/h ;檢 測方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描（MRM) ;29種獸藥的保留時間及質(zhì)譜采集參數(shù)見表2。
[0019] 本發(fā)明方法解決了四環(huán)素類獸藥難與其他多類獸藥同時提取、凈化的難題，同時 簡化了樣品處理步驟，具有高效、快速、成本低、操作簡便等優(yōu)勢，凈化效果好，靈敏度高，準 確度和精密度均符合多殘留分析方法的要求。與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明方法具有以下優(yōu)良效 果。
[0020] (1)本發(fā)明方法采用改進的QuEChERS方法處理樣品，使四環(huán)素類獸藥可與其他多 類獸藥同時提取、凈化，同時測定，具有高效、快速的優(yōu)勢。
[0021] (2)本發(fā)明方法采用McIlvaine緩沖液-乙腈混合溶液作為提取液，提取液不濃 縮，而是鹽析除去緩沖鹽，取乙腈相經(jīng)分散固相萃取凈化后測定，避免了緩沖鹽對質(zhì)譜的污 染，操作簡便，成本低，凈化效果好。
[0022] (3)本發(fā)明方法采用選擇性好，抗干擾能力強的UPLC-MS/MS方法檢測，穩(wěn)定性好， 靈敏度高，準確度和精密度均符合多殘留分析方法的要求。
[0023] 本發(fā)明方法的檢測限：
[0024] 以信噪比為3計算方法的檢出限，以信噪比大于等于10確定方法的定量限，29種 獸藥的檢測限在〇. 5~6. 0 μ g/kg之間。四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素的定量限為 10 μ g/kg，其他獸藥的定量限均為5 μ g/kg。
[0025] 本發(fā)明方法的線性：
[0026] 為了消除基質(zhì)效應(yīng)，采用基質(zhì)匹配標準工作溶液繪制標準曲線。以各組分的濃度 為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，線性方程和相關(guān)系數(shù)見表3。29種獸藥在 2. 5~50 μ g/L濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0. 993~0. 999。
[0027] 本發(fā)明方法的準確度和精密度：
[0028] 在5、10、20和50 μ g/kg四個濃度水平做加標回收試驗，每個濃度水平做5個平行 樣品，分別進行樣品前處理和UPLC-MS/MS分析，并按照加標量和測定值計算回收率。動物 組織中29種獸藥的平均回收率和相對標準偏差（RSD)見表4。由表4可以看出，29種獸藥 在雞肉、雞肝、豬肉和豬肝四種動物組織中的平均回收率在71. 5%和93. 2%之間，相對標 準偏差在〇. 8%和7. 7%之間，符合多殘留分析的要求。
[0029] 表2 29種獸藥的保留時間和質(zhì)譜采集參數(shù)
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[0031] 表3 29種獸藥的標準曲線、相關(guān)系數(shù)和靈敏度
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[0033] 表4 雞肉、雞肝、豬肉和豬肝樣品中29種獸藥的加標回收率及相對標準偏差（η =5)
[0034]


【具體實施方式】
[0037] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的說明，實施例僅為解釋性的，決不意味著它 以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0038] 實施例1
[0039] 以供試雞肉樣品A為樣本，采用本發(fā)明方法進行樣品前處理，采用超高效液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。制備方法如下：
[0040] 1、儀器與試劑：