μ?、0.0001-30 ng/mL的一系列不同濃度的抗原溶液，晾干后超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中干燥；
取6 PL的Pt/PdCu-三維石墨烯二抗標記物溶液，滴涂于電極表面，置于4 °(:冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三維石墨烯構(gòu)建的免疫傳感器。
[0014]實施例4 Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀溶液的制備
(1)取 1.5 mL、5.7 mg.mL 1 PdClj.#液，3.2 mL、7.0 mg.mL 1 氧化石墨稀溶液，10 mgCuS04.5H20，40 mg谷氨酸鹽置于250 mL燒杯中，再加入35 mL乙二醇，超聲，磁力攪拌2h ;用7 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右；將混合溶液移入50 mL高壓反應(yīng)釜中，160°C條件下加熱6 h，冷卻至室溫；
(2)將所得物質(zhì)移入含有15mg谷氨酸鹽，0.9 mL、2.5 mg.mL 1 H2PtCl6.6H20的乙二醇溶液的燒杯中，用7 wt% KOH/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右，然后移至反應(yīng)釜，在160 °C下反應(yīng)2.5 h ;
(3)用超純水洗滌幾次，將洗滌后的物質(zhì)放入冰箱中冷凍結(jié)冰，最后用冷凍干燥機干燥得到Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀。
[0015]實施例5 Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀溶液的制備
(1)取1.5 mL、6.7 mg.mL 1 PdCl；^.#液，3.2 mL、8.0 mg.mL 1 氧化石墨稀溶液，15 mgCuS04.5H20，50 mg谷氨酸鹽置于250 mL燒杯中，再加入40 mL乙二醇，超聲，磁力攪拌2h ;用8 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右；將混合溶液移入50 mL高壓反應(yīng)釜中，160°C條件下加熱7 h，冷卻至室溫；
(2)將所得物質(zhì)移入含有20mg谷氨酸鹽，0.9 mL、3.0 mg.mL 1 H2PtCl6.6H20的乙二醇溶液的燒杯中，用8 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右，然后移至反應(yīng)釜，在160 °C下反應(yīng)3 h ；
(3)用超純水洗滌幾次，將洗滌后的物質(zhì)放入冰箱中冷凍結(jié)冰，最后用冷凍干燥機干燥得到Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀。
[0016]實施例6 Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀溶液的制備
(1)取1.5 mL、7.7 mg.mL 1 PdClj.#液，3.2 mL、9.0 mg.mL 1 氧化石墨稀溶液，20 mgCuS04.5H20，60 mg谷氨酸鹽置于250 mL燒杯中，再加入45 mL乙二醇，超聲，磁力攪拌2h ;用9 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右；將混合溶液移入50 mL高壓反應(yīng)釜中，160°C條件下加熱8 h，冷卻至室溫；
(2)將所得物質(zhì)移入含有25mg谷氨酸鹽，0.9 mL、3.5 mg.mL 1 H2PtCl6.6H20的乙二醇溶液的燒杯中，用9 wt% Κ0Η/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右，然后移至反應(yīng)釜，在160 °C下反應(yīng)3.5 h ;
(3)用超純水洗滌幾次，將洗滌后的物質(zhì)放入冰箱中冷凍結(jié)冰，最后用冷凍干燥機干燥得到Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀。
[0017]實施例7電化學(xué)免疫傳感器用于鱗狀癌細胞抗原的檢測
(1)使用電化學(xué)工作站連接飽和甘汞電極，鉑絲電極，制備的免疫傳感器電極，底液為10 mL、pH 5.5 ~ 8.0 的 PBS 緩沖溶液；
(2)用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運行時間 200 s ；
(3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL的PBS中注入10 μ L 5 mol/L的雙氧水溶液，然后記錄電流變化；
(4)根據(jù)所得電流強度與鱗狀癌細胞抗原濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線，測得線性范圍為 0.1 pg/mL ~ 30 ng/mL，檢測限為 0.025 pg/mL。
[0018]實施例8電化學(xué)免疫傳感器用于癌胚抗原的檢測
繪制工作曲線步驟同實施例7，按照繪制工作曲線的方法進行癌胚抗原樣品分析，測得線性范圍為 0.1 pg/mL ~ 25 ng/mL，檢測限為 0.025 pg/mL。
[0019]實施例9電化學(xué)免疫傳感器用于甲胎蛋白的檢測繪制工作曲線步驟同實施例7，按照繪制工作曲線的方法進行甲胎蛋白樣品分析，測得線性范圍為0.5 pg/mL ~ 30 ng/mL，檢測限為0.13 pg/mL。
【主權(quán)項】
1.一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀標記的電化學(xué)免疫傳感器的制備，其特征在于，包括以下步驟: (1)將直徑為4mm的玻碳電極用A1203拋光粉打磨，超純水清洗干凈； (2)取6μ?、0.5-1.5 mg.mL 1環(huán)糊精功能化的石墨稀溶液滴加到電極表面，室溫下瞭干，用超純水沖洗電極表面，晾干； (3)滴加6μ?、5~10 μδ.πι? 1的抗體，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干； (4)滴加3PL質(zhì)量分數(shù)為1%的牛血清白蛋白溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干； (5)滴加6μ?、0.0001-30 ng/mL的一系列不同濃度的抗原溶液，晾干后用超純水沖洗電極表面，4°C冰箱中晾干； (6)取6PL的Pt/PdCu-三維石墨烯二抗標記物溶液，滴涂于電極表面，置于4 °C冰箱中晾干，制得Pt/PdCu-三維石墨烯構(gòu)建的免疫傳感器。2.如權(quán)利要求1所述的一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學(xué)免疫傳感器的制備，所述的Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀溶液，制備步驟如下:(1)取1.5 mL、5.7-7.7 mg.mL 1 PdCl2S液，3.2 mL、7.0~9.0 mg.mL 1 氧化石墨稀溶液，10~20 mg CuS04.5H20，40~60 mg谷氨酸鹽置于250 mL燒杯中，再加入35~45 mL乙二醇，超聲，磁力攪拌2 h ;用7?9 wt% KOH/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右；將混合溶液移入50 mL高壓反應(yīng)釜中，160 °C條件下加熱6~8 h，冷卻至室溫； (2)將所得物質(zhì)移入含有15-25 mg 谷氨酸鹽，0.9 mL、2.5-3.5 mg.mL 1 H2PtCl6.6Η20的乙二醇溶液的燒杯中，用7~9 wt% KOH/乙二醇溶液調(diào)節(jié)pH到13左右，然后移至反應(yīng)釜，在 160 °C 下反應(yīng) 2.5-3.5 h ； (3)用超純水洗滌幾次，將洗滌后的物質(zhì)放入冰箱中冷凍結(jié)冰，最后用冷凍干燥機干燥得到Pt/PdCu納米立方體-三維石墨稀。3.如權(quán)利要求1所述的一種基于Pt/PdCu納米立方體-三維石墨烯標記的電化學(xué)免疫傳感器的制備，其特征在于，用于腫瘤標志物的檢測，檢測步驟如下: (1)使用電化學(xué)工作站連接飽和甘汞電極，鉑絲電極，制備的免疫傳感器電極，底液為10 mL、pH值為7.0的PBS緩沖溶液； (2)用時間-電流法對分析物進行檢測，輸入電壓為-0.4V，取樣間隔0.1 s，運行時間 200 s ； (3)當背景電流趨于穩(wěn)定后，每隔50s向10 mL的PBS中注入10 yL 5 mol/L的雙氧水溶液，然后記錄電流變化； (4)根據(jù)所得電流強度與腫瘤標志物濃度之間的線性關(guān)系，繪制工作曲線。4.根據(jù)權(quán)利要求1~3所述的腫瘤標志物，其特征在于，所述腫瘤標志物選自以下之一:鱗狀癌細胞抗原(SCCA)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)、乳腺癌易感基因(CA15-3)、卵巢癌糖類抗原(CA125)、前列腺特異性抗原(PSA)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于Pt/PdCu-三維石墨烯標記的電化學(xué)免疫傳感器的制備及應(yīng)用。該傳感器采用環(huán)糊精功能化的石墨烯作為基底，通過環(huán)糊精與抗體的主客體識別作用，實現(xiàn)捕獲抗體的固定，然后利用具有良好電化學(xué)催化性能的Pt/PdCu-三維石墨烯復(fù)合材料作為檢測抗體標記物，構(gòu)建了一種夾心型免疫傳感器，實現(xiàn)了對多種腫瘤標志物的高靈敏檢測，對腫瘤標志物的早期診斷具有重要的意義。
【IPC分類】G01N27/26, G01N33/574, G01N27/327
【公開號】CN105319254
【申請?zhí)枴緾N201510837818
【發(fā)明人】劉媛媛, 馬洪敏, 魏琴, 張勇, 吳丹, 李燕
【申請人】濟南大學(xué)
【公開日】2016年2月10日
【申請日】2015年11月26日