適用茶葉中吡蟲啉等3種農(nóng)藥多殘留速測法及所用試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小分子化合物的金標(biāo)免疫分析檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于直接競爭 免疫層析法的農(nóng)藥殘留金標(biāo)速測試紙條，該試紙條適用于茶葉樣品中氯代煙堿類農(nóng)藥化蟲 嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟的多殘留快速檢測。
【背景技術(shù)】
[0002] 自美國、歐盟、日本加強對進口食品、農(nóng)產(chǎn)品檢疫檢驗力度后，我國茶葉出口呈現(xiàn) 大幅下降的趨勢，其主要原因是農(nóng)藥超標(biāo)困擾我國茶葉出口。近幾年來，由于化蟲嘟等氯代 煙堿類農(nóng)藥在茶葉上使用頻率高，導(dǎo)致化蟲嘟等農(nóng)藥在茶葉上檢出率高。2014年8月青島 出入境檢驗檢疫局對一批進口烏龍茶實施抽樣檢驗時檢出化蟲嘟超標(biāo)2倍，進口茶葉也存 在氯代煙堿農(nóng)藥超標(biāo)問題。歐盟食品安全局巧FSA)發(fā)布的報告指出，新煙堿類農(nóng)藥對授粉 昆蟲構(gòu)成"嚴重風(fēng)險"，運類農(nóng)藥與蜜蜂死亡有關(guān)。鑒于蜜蜂大量死亡，可能影響農(nóng)作物的授 粉，2013年5月歐盟的15個成員國舉行投票，同意實行臨時禁令，在未來兩年將禁用化蟲 嘟、嚷蟲胺W及嚷蟲嗦3種新煙堿類農(nóng)藥。
[0003] 鑒于常規(guī)的農(nóng)藥殘留檢測儀器分析方法（如氣相、液相色譜及質(zhì)譜聯(lián)用）滿足不 了茶葉樣品在較短時間內(nèi)完成快速檢測的需求，因此，人們迫切希望有一種簡便、快速、價 廉及信息量大的農(nóng)殘檢測技術(shù)能在野外現(xiàn)場和實驗室內(nèi)進行大批量的快速篩查試驗。迄 今，常見的農(nóng)藥殘留現(xiàn)場快速篩查方法為酶抑制顯色紙片法，但其檢測假陽性比率偏高，受 基質(zhì)干擾大，檢測對象局限于有機憐類和氨基甲酸醋類農(nóng)藥，且特異性不高。近些年來，基 于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫化學(xué)分析法是農(nóng)殘快速檢測技術(shù)的研究熱點之一，其中研 究報道最多的是酶聯(lián)免疫吸附法巧LISA)，已研制出多類農(nóng)藥化ISA試劑盒，確實有潛在的 市場應(yīng)用前景，但檢測需要多步反應(yīng)，仍不能真正實現(xiàn)現(xiàn)場快速篩查。
[0004] 膠體金標(biāo)記技術(shù)是繼同位素、酶、巧光素及乳膠標(biāo)記技術(shù)之后的一種新型實用的 標(biāo)記技術(shù)?；谀z體金免疫層析技術(shù)的試紙條W其使用便捷、價格低廉、篩查結(jié)果可視化、 環(huán)境友好性等獨特優(yōu)勢更受大眾歡迎。近些年來，適用于檢測小分子化合物的競爭型金標(biāo) 試紙條研發(fā)也越來越多，有關(guān)農(nóng)藥方面的公開報道集中在=嗦類、有機憐類、氨基甲酸醋 類，而針對新煙堿類農(nóng)藥金標(biāo)試紙條的僅設(shè)及化蟲嘟、嚷蟲嗦和嚷蟲胺單殘留或雙殘留的 測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、靈敏度高、結(jié)果可視化、適用于現(xiàn) 場速測等優(yōu)點的適用于茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥多殘留現(xiàn)場速測試紙條（基于 間接競爭免疫層析法的農(nóng)藥多殘留金標(biāo)速測試紙條）及其具體使用方法。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種適用于茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類 農(nóng)藥多殘留速測的異源競爭免疫層析金標(biāo)試紙條（基于直接競爭免疫層析法的氯代煙堿 類農(nóng)藥金標(biāo)速測試紙條），該試紙條包括襯板（例如為PVC襯板）、樣品墊（例如為玻璃纖 維樣品墊）、金標(biāo)一抗結(jié)合墊、硝酸纖維素膜---NC膜、吸水墊，所述金標(biāo)一抗結(jié)合墊上包被 有膠體金標(biāo)記的化蟲嘟類特異性小鼠單抗（一抗），硝酸纖維素膜一-NC膜上包被有用于 異源競爭的氯嚷嘟或嚷蟲胺人工抗原的檢測線一-T線和包被有兔抗鼠IgG(二抗）的質(zhì)控 線C線。
[0007] 備注說明：在本發(fā)明中，化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥就是指化蟲嘟、嚷蟲胺和氯 嚷嘟。
[0008] 作為本發(fā)明的適用于茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥多殘留速測的異源競 爭免疫層析金標(biāo)試紙條的改進：膠體金標(biāo)記的化蟲嘟類特異性小鼠單抗（一抗）是由20~ 40nm(例如為30nm)的納米金顆粒與化蟲嘟類特異性小鼠單抗相結(jié)合的復(fù)合物，化蟲嘟類 特異性小鼠單抗與膠體金的結(jié)合濃度為3~lOmg/L(較佳為4mg/L)，即，每1L的膠體金溶 液中配用3~10mg(較佳為4mg)的化蟲嘟類特異性小鼠單抗。
[0009] 備注說明：該化蟲嘟類特異性小鼠單抗（一抗）對化蟲嘟、氯嚷嘟和嚷蟲胺的識別 能力接近。膠體金溶液中膠體金的質(zhì)量濃度為0.01 %;包被量為0.4~0.6iiL/mm2 (較佳 為 0. 5yL/mm2)。
[0010] 作為本發(fā)明的適用于茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥多殘留速測的異源競 爭免疫層析金標(biāo)試紙條的進一步改進：檢測線一-T線包被的用于異源競爭的氯嚷嘟或 嚷蟲胺人工抗原是指將氯嚷嘟半抗原或嚷蟲胺半抗原偶聯(lián)到雞卵清蛋白（OVA)上的人 工抗原，濃度為100~500mg/L;氯嚷嘟半抗原或嚷蟲胺半抗原與OVA的偶聯(lián)比為8:1~ 15:1(例如為 10:1)。 W11] 兔抗鼠IgG(二抗）的質(zhì)控線---C線的濃度為50~200mg/L。
[0012] T線和C線的包被量均為0. 04~0. 06yL/mm(較佳為0. 05yL/mm)。
[0013] 作為本發(fā)明的適用于茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥多殘留速測的異源競 爭免疫層析金標(biāo)試紙條的進一步改進：所述檢測線和質(zhì)控線所用的稀釋液是質(zhì)量濃度1~ 5%薦糖的0.011?85溶液任^.4憐酸緩沖溶液，口^.4憐酸鹽口85緩沖液）。
[0014] 本發(fā)明還同時提供了利用上述試紙條進行的茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng) 藥多殘留速測法：W茶葉鮮葉、成品茶作為待測樣品；
[0015] 直接用開水沖泡待測樣品30~60分鐘，得茶湯；或者，先將待測樣品研磨成粉狀 后，加入開水沖泡30~60分鐘，得茶湯；
[0016] 取茶湯滴加2~3滴到樣品墊的點樣區(qū)（該點樣區(qū)位于樣品墊的中間位置）中進 行層析反應(yīng)，5~10分鐘后根據(jù)檢測線和質(zhì)控線的顯色情況直接判斷樣品中農(nóng)藥的陰陽性 結(jié)果；
[0017] 質(zhì)控線一-C線顯紅色表示試紙條有效，未顯色則試紙條失效；
[0018] 檢測線一-T線顯紅色則判斷為陰性，表示茶湯中表示茶湯中未檢測到化蟲嘟、嚷 蟲胺和氯嚷嘟中的任何一種，或茶湯中運3種農(nóng)藥總濃度低于0. 005mg/L;
[0019] 檢測線一-T線未顯色則判斷為陽性，表示茶湯中化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟總濃度 高于（> )0. 005mg/L。
[0020] 備注說明：粉紅色即顯色不完全，表示偏陽性，且"檢測線一-T線未顯色"比"T線 顯示淺紅色"代表茶湯中化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟殘留的濃度高。
[0021] 作為本發(fā)明的茶葉中化蟲嘟等3種氯代煙堿類農(nóng)藥多殘留速測法的改進：
[0022] 所述成品茶包括：綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶、黑茶。
[0023] 在本發(fā)明中，采用質(zhì)量濃度1-5%薦糖的0.011?85溶液任^.4憐酸鹽口85緩沖 液）作為稀釋液可W保護包被抗原和包被二抗，從而延長抗原和二抗的活性。
[0024] 本發(fā)明采用的是一種間接封閉模式，即樣品墊中完全吸附封閉液并作干燥處理， 在樣品檢測過程中待測樣品帶動樣品墊上的封閉液到NC膜上，從而達到間接封閉的效果。 異源競爭的氯嚷嘟或嚷蟲胺抗原是指將氯嚷嘟或嚷蟲胺半抗原偶聯(lián)到雞卵清蛋白（OVA) 上的復(fù)合物。本發(fā)明的速測試紙條可檢測茶葉中的3種氯代煙堿類農(nóng)藥，分別是化蟲嘟、嚷 蟲胺和氯嚷嘟。所述的茶葉種類包括中國六大茶類：綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶、黃茶、黑茶。 [00巧]本發(fā)明的有益效果：本試紙條采用膠體金標(biāo)記化蟲嘟一抗（膠體金標(biāo)記的化蟲嘟 類特異性小鼠單抗）作為免疫金標(biāo)探針，可W同時監(jiān)測茶葉中化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟運3 種氯代煙堿類農(nóng)藥的殘留，是一種快速簡便的多殘留篩查手段。本發(fā)明根據(jù)之前已公開報 道的化蟲嘟抗原制備得到了化蟲嘟類特異性單抗，能同時識別化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟運3 種氯代煙堿類農(nóng)藥，同時選用氯嚷嘟或嚷蟲胺人工抗原來建立異源競爭免疫層析技術(shù)，運 有利于提高競爭式免疫層析法的靈敏度。所制備的多殘留檢測試紙條對茶湯樣品中3種氯 代煙堿類農(nóng)藥的肉眼判斷靈敏度均可達到〇.〇〇5mg/L。本發(fā)明的試紙條具有靈敏度高、特異 性好、使用便捷、結(jié)果可視化等優(yōu)點，將來有望在其他農(nóng)產(chǎn)品上得到應(yīng)用拓展。
[00%] 化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟3種農(nóng)藥同時檢測的金標(biāo)試紙條還未見公開報道，本發(fā) 明首次制備了該測試紙條。
[0027] 與現(xiàn)有的速測試紙條方法原理相比，本發(fā)明利用了化蟲嘟類特異性抗體與抗原的 異源反應(yīng)原理，實現(xiàn)了化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟3種農(nóng)藥的多殘留檢測，具有檢測譜寬、靈 敏度高、特異性好、使用便捷、結(jié)果準確等優(yōu)點。本發(fā)明具備良好的實用性，試紙條可應(yīng)用于 現(xiàn)場篩查茶葉鮮葉和成品茶樣品中3種氯代煙堿類農(nóng)藥殘留量及超標(biāo)檢測與診斷，檢出限 均為0. 005mg/l，符合我國現(xiàn)行食品安全標(biāo)準要求，檢測時間5~10分鐘。該產(chǎn)品技術(shù)具有 靈敏度高、使用便捷、結(jié)果準確、成本低的優(yōu)點，對于加強茶葉生產(chǎn)的質(zhì)量安全監(jiān)督管理具 有良好的應(yīng)用前景。
[0028] 綜上所述，本發(fā)明采用化蟲嘟類特異性單抗和氯嚷嘟或嚷蟲胺抗原建立了異源競 爭免疫層析技術(shù)，所制備的金標(biāo)試紙條能同時檢測化蟲嘟、氯嚷嘟和嚷蟲胺3種氯代煙堿 類農(nóng)藥，且重點應(yīng)用于茶葉樣品中上述3種農(nóng)殘的速測。同時本產(chǎn)品能夠?qū)崿F(xiàn)茶葉現(xiàn)場采 摘時對化蟲嘟、嚷蟲胺和氯嚷嘟進行快速篩查，若發(fā)現(xiàn)茶葉中該類農(nóng)藥超標(biāo)可通過延緩采 摘時間等方式來降低茶葉中的農(nóng)藥殘留。目P，通過此判定方法直接判斷樣品中化蟲嘟、嚷蟲 胺和氯嚷嘟的陰陽性結(jié)果，檢測靈敏度高、使用快捷、結(jié)果直觀。
【附圖說明】
[0029] 下面結(jié)合附圖