顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工 藝及圖像合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 借助于儀器儀表行業(yè)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，生物組織微觀重建技術(shù)在近些年 的發(fā)展非常迅速。近一個(gè)多世紀(jì)以來，在科技快速發(fā)展的同時(shí)，包括人類在內(nèi)的整個(gè)地球生 物界都面臨越來越多的威脅，如各種新型疾病的出現(xiàn)、物種的加速消失等。雖然近些年生物 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?qū)τ趥€(gè)別疾病的研究取得了重大進(jìn)展，但對(duì)于整個(gè)地球生物界面臨的威脅而言， 這樣的進(jìn)展遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。只有從最基本層面，即微觀尺度上，將生物體的結(jié)構(gòu)、功能以及二者 的相互關(guān)系研究透徹，我們才能找到從根本上治療疾病的方法，并能以此預(yù)測(cè)并預(yù)防一些 新型疾病的出現(xiàn)。
[0003] 隨著電子顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用，雖然從分辨率方面比傳統(tǒng)的光學(xué) 顯微鏡提高了 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)，但電子顯微鏡對(duì)所觀察樣品的制備要求也更高。自從Watson 在1958年首先提出鉛化合物可以增加超薄切片中細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的反差以來，目前國(guó)內(nèi)外 多采用Reynolds在1963年提出的檸檬酸鉛作為常規(guī)鉛染液。但多年來，超薄切片的鉛污 染卻是許多實(shí)驗(yàn)室普遍存在的問題，它直接影響著切片的質(zhì)量和電鏡觀察效果，原因在于 過去所用的鉛染液在接觸空氣中的二氧化碳后易產(chǎn)生碳酸鉛沉淀污染切片。而且鉛染液不 能長(zhǎng)期貯存，否則污染會(huì)更加嚴(yán)重。為了解決這個(gè)問題，Hanaichi等在1986年改進(jìn)了鉛染 液配方和染色方法并取得了一定效果。近幾年來，德國(guó)馬克普朗克神經(jīng)生物學(xué)研究所和美 國(guó)哈佛大學(xué)針對(duì)生物組織樣品掃描電子顯微鏡SEM成像的制備方法進(jìn)行了進(jìn)一步改進(jìn)，雖 然對(duì)SEM圖像襯度有較大提升，但對(duì)于算法自動(dòng)識(shí)別圖像中生物組織微觀結(jié)構(gòu)還有一定距 離。
[0004] 基于上述生物樣品制備技術(shù)的發(fā)展，生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要發(fā)展了四種微觀重建方 式。第一種是序列切片透射電鏡成像方法，即SSTEM，該方法先用切片機(jī)對(duì)生物組織樣品塊 切片，并將序列切片收集在單孔銅網(wǎng)上并根據(jù)切片的順序編號(hào)，然后利用TEM成像。第二種 是連續(xù)樣品表面掃描電鏡成像方法，即SBEM，這種方式是在掃描電鏡內(nèi)部?jī)?nèi)置了高精度的 鉆石刀，通過鉆石刀對(duì)樣品表面進(jìn)行間歇性等厚度切削，每次切削后利用SEM對(duì)暴露出的 樣品表面進(jìn)行成像。第三種是聚焦離子束-掃描電鏡方式，即FIB-SEM，該方式用FIB的離 子束對(duì)樣品表面進(jìn)行切削后再利用電子束進(jìn)行成像。第四種是自動(dòng)卷帶超薄切片機(jī)掃描電 鏡成像方式，即ATUM-SEM，該方法通過自動(dòng)切片、收集系統(tǒng)將超薄切片收集到專用條帶上， 然后放入SEM中進(jìn)行成像。ssTEM是四種微觀重建方式中分辨率最高的一種，這得益于TEM 本身的高分辨率，其余三種方式都是利用SEM成像。但由于切片是收集在單孔銅網(wǎng)上，并且 受制于TEM的視場(chǎng)大小，所以這種方式只適用于體量較小的生物組織微觀重建，一般在臨 床醫(yī)學(xué)方面應(yīng)用較多。SBEM和FIB-SEM方式由于采用的是對(duì)生物組織樣品塊切削后原位 拍照，故其后續(xù)圖像配準(zhǔn)的難度和工作量都大大降低。這兩種方式采用的都是對(duì)塊體斷面 進(jìn)行背散射電子成像，并且為了盡可能減少電子束對(duì)樣品塊表面造成的損傷，否則會(huì)改變 樣品塊表面的物理化學(xué)特性進(jìn)而影響后續(xù)鉆石刀或離子束對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的切削，拍照時(shí) 通常選用較低的電壓和比較小的圖像獲取時(shí)間，所以得到的圖像一般分辨率和信噪比均較 差。此外，由于SBEM和FIB-SEM方式對(duì)樣品而言是破壞性的，所以在進(jìn)行一些珍貴生物樣 本或大體量樣本的三維重建時(shí)，對(duì)系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求非常高，尤其是鉆石刀的潔凈度和FIB 離子源的穩(wěn)定性方面。ATUM-SEM方式的最大優(yōu)點(diǎn)有兩個(gè)，一是在拍照前就可以確定序列切 片的連續(xù)性，二是切片可以重復(fù)使用，即當(dāng)出現(xiàn)個(gè)別切片所拍照片滿足不了三維重建需要 時(shí)可以重新拍攝。簡(jiǎn)而言之，ATUM-SEM方式可以確保生物組織三維重建數(shù)據(jù)的完整性。目 前，SBEM和ATUM-SEM方式在體量較大的生物組織微觀重建中應(yīng)用較多。
[0005] 自從十九世紀(jì)末科學(xué)家首次在顯微鏡下檢測(cè)到神經(jīng)細(xì)胞以來，已經(jīng)發(fā)生了很多事 情。健康及病變大腦的解剖學(xué)、化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)，已經(jīng)得以廣泛的探討。然而，人的想法 和感受如何來自單個(gè)細(xì)胞的活性？當(dāng)細(xì)胞從網(wǎng)絡(luò)上分離時(shí)會(huì)發(fā)生什么？目前還不明確。因 此，了解神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的連接并發(fā)現(xiàn)所有這些連接，對(duì)于聯(lián)接組學(xué)的目標(biāo)顯然是很重要的。為了 更好的理解"大腦是如何工作的"，美國(guó)和歐盟相繼推出了各自的"腦計(jì)劃"。但就目前國(guó)內(nèi) 外報(bào)道的三維重建技術(shù)而言，完成大體量生物組織（如鼠腦或人腦）三維重建仍然面臨諸 多挑戰(zhàn)。首先，在生物樣品制備和圖像獲取方面，目前很難獲得兼具襯度一致性好、組織結(jié) 構(gòu)邊緣銳度較理想的圖像，且由于SEM成像主要采用圖像獲取速率較慢背散射電子成像， 導(dǎo)致生物組織樣品的圖像獲取周期太長(zhǎng)。其次，利用算法對(duì)已有報(bào)道中所獲取到的背散射 電子圖像進(jìn)行生物微觀組織結(jié)構(gòu)自動(dòng)識(shí)別時(shí)遇到了較大挑戰(zhàn)，主要表現(xiàn)在識(shí)別準(zhǔn)確率和效 率方面。因此，尋找一種能快速獲取到襯度一致性好、組織結(jié)構(gòu)邊緣銳度理想的生物組織電 子顯微圖像的方法是生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域一直努力的目標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供的顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成方法，可以提高 生物微觀結(jié)構(gòu)的三維重建精度和效率。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成方 法，包括：
[0008] 采集生物組織切片，將所述生物組織切片通過掃描電子顯微鏡SEM觀察得到第一 生物組織切片圖像；將所述生物組織切片進(jìn)行刻蝕處理得到刻蝕的生物組織切片，并將所 述刻蝕的生物組織切片通過所述SEM觀察得到第二生物組織切片圖像；將所述第一生物組 織切片圖像和所述第二生物組織切片圖像進(jìn)行融合得到融合的生物組織切片圖像。
[0009] 本發(fā)明實(shí)施例提供的顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成方法，通 過采集生物組織切片，將生物組織切片通過掃描電子顯微鏡SEM觀察得到第一生物組織切 片圖像，將生物組織切片進(jìn)行刻蝕處理得到刻蝕的生物組織切片，并將刻蝕的生物組織切 片通過所述SEM觀察得到第二生物組織切片圖像，將第一生物組織切片圖像和第二生物組 織切片圖像進(jìn)行融合得到融合的生物組織切片圖像，可以提高生物微觀結(jié)構(gòu)的三維重建精 度和效率。
【附圖說明】
[0010] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成 方法流程圖；
[0011] 圖2A為本發(fā)明實(shí)施例提供的大腦鼠超薄切片在等離子刻蝕前的SEM圖像；
[0012] 圖2B為本發(fā)明實(shí)施例提供的大腦鼠超薄切片在等離子刻蝕后的SEM圖像；
[0013] 圖2C為本發(fā)明實(shí)施例提供的大腦鼠超薄切片在等離子刻蝕前后融合的SEM圖 像；
[0014] 圖3A為本發(fā)明實(shí)施例一提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕前的SEM圖像；
[0015] 圖3B為本發(fā)明實(shí)施例一提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕后的SEM圖像；
[0016] 圖3C為本發(fā)明實(shí)施例一提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕前后融合的SEM圖 像；
[0017] 圖4A為本發(fā)明實(shí)施例二提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕前的SEM圖像；
[0018] 圖4B為本發(fā)明實(shí)施例二提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕后的SEM圖像；
[0019] 圖4C為本發(fā)明實(shí)施例二提供的果蠅腦超薄切片在等離子刻蝕前后融合的SEM圖 像。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施例提供的顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及 圖像合成方法進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0021] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的顯著化生物組織切片膜結(jié)構(gòu)的刻蝕工藝及圖像合成 方法流程圖。
[0022] 參照?qǐng)D1，在步驟S101，采集生物組織切片，將所述生物組織切片通過掃描電子顯 微鏡SEM觀察得到第一生物組織切片圖像。
[0023] 這里，生物組織樣品塊包括腦組織和肌肉組織等，通過生物組織樣品獲取生物組 織切片的步驟具體如下：
[0024] 在步驟S1011，通過修塊機(jī)對(duì)生物組織樣品塊進(jìn)行粗修，將前端多余的空白樹脂盡 可能多的去除。
[0025] 在步驟S1012,然后固定在超薄切片機(jī)上，用修塊刀精細(xì)修整生物組織外樹脂，直 至目標(biāo)生物組織露出。
[0026] 在步驟S1013,然后使用清潔后的鉆石刀進(jìn)行超薄切片，厚度為50~70nm。
[0027] 在步驟S1014,最后將水槽內(nèi)的超薄切片收集到玻片或硅片表面，室溫下等待切片 充分干燥后放入SEM觀察，從而獲取第一生物組織切片圖像。第一生物組織切片圖像即為 刻蝕前的生物組織切片圖像。如選用玻片作為收片載體，在進(jìn)行SEM觀察前需對(duì)其表面進(jìn) 行蒸碳處理。
[0028] 在步驟S102,將所述生物組織切片進(jìn)行刻蝕處理得到刻蝕的生物組織切片，并將 所述刻蝕的生物組織切片通過所述SEM觀察得到第二生物組織切片圖像。
[0029] 這里，對(duì)生物組織切片進(jìn)行刻蝕處理的步驟具體如下：
[0030] 在步驟S1021，將表面收集有生物超薄切片的玻片或硅片放置于等離子刻蝕機(jī)樣 品腔室內(nèi)，用耐高溫膠帶將其固定在樣品臺(tái)上，關(guān)閉艙門并設(shè)置刻蝕功率、工藝氣體種類及 流量、工作壓力、刻蝕時(shí)間等參數(shù)，具體參數(shù)的設(shè)定可參見表1。
[0031] 表1
[0032]
[0033] 在步驟S1022,然后啟動(dòng)刻蝕程序。當(dāng)選擇較低的功率時(shí)，氣體（可選擇單一氣體 或混合氣體）流量需適當(dāng)增大，這樣才能保證在刻蝕期間等離子體的穩(wěn)定性。
[0034] 在步驟S1023,刻蝕結(jié)束后，將樣品腔室的真空放掉，取出玻片或硅片用于掃描電 鏡觀察，從而得到第二生物組織切片圖像，第二生物組織切片圖像即為刻蝕后的圖像。如選 用玻片作為收片載體，在進(jìn)行SEM觀察前需對(duì)其表面進(jìn)行蒸碳處理。
[0035] 在步驟S103,將所述第一生物組織切片圖像和所述第二生物組織切片圖像進(jìn)行融 合得到融合的生物組織切片圖像。
[0036] 進(jìn)一步地，所述將所述第一生物組織切片圖像和所述第二生物組織切片圖像進(jìn)行 融合得到融合的生物組織切片圖像包括：
[0037] 通過目標(biāo)函數(shù)將所述第一生物組織切片圖像的紋理部分和所述第二生物組織切 片圖像的紋理部分進(jìn)行配準(zhǔn)，從而得到向量場(chǎng)；
[0038] 根據(jù)所述向量場(chǎng)對(duì)所述第一生物組織切片圖像以所述第二生物組織切片為基準(zhǔn) 進(jìn)行校正得到配準(zhǔn)圖像；
[0039] 根據(jù)所述配準(zhǔn)圖像和所述第一生物組織切片圖像得到所述融合的生物組織切片 圖像。
[0040] 進(jìn)一步地，所述根據(jù)所述配準(zhǔn)圖