07 特異性抗原的濃度為〇. 5-3. 0 μ g/mL ; 2. Irgacure 907特異性抗體工作液：該Irgacure 907特異性抗體的濃度為 0. 5-3. 0 μ g/mL ； 所述Irgacure 907特異性抗原與Irgacure 907特異性抗體的用量比為1:1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括有酶標(biāo)二抗， 所述酶標(biāo)二抗是濃度按1:8000的比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述Irgacure 907 特異性抗原為Irgacure 907與載體蛋白的偶聯(lián)物，該Irgacure 907特異性抗原的濃度為 2 μ g/mL ;所述Irgacure 907特異性抗體為鼠源單克隆抗體，該Irgacure 907特異性抗體 的濃度為2 μ g/mL。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒，其特征在于，還包括Irgacure 907標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述載體蛋白為兔 血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述Irgacure 907標(biāo)準(zhǔn) 品溶液的濃度分別為 lXlOig/UlXloVg/LUXlO1 yg/L、lX10°yg/L、0.1 yg/L ;所 述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B組成，所述顯色劑A為過(guò)氧化氫或過(guò)氧化脲，所述顯 色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所述洗滌液為含有0. 05% -0. 5%吐溫-20的0. 01M， PH7. 5的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為l-2mol/L的硫酸溶液；所述封閉液為含5%脫脂奶 粉的0. 01M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液；所述濃縮樣品稀釋液為0. 01M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液； 所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯中的一種。6. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，主 要包括以下步驟： 1) 制備Irgacure 907特異性抗原： 將Irgacure 907溶解于二氯甲烷中，反應(yīng)體系溫度控制在-KTC至_1°C，滴加三溴 化硼二氯甲烷后恢復(fù)至室溫，反應(yīng)完全后在〇°C冰水淬滅，抽濾得到帶有酚巰基的2-甲 基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮；將上述2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮和碳酸鉀分散于二甲 基甲酰胺中，加入4-溴丁酸乙酯，加熱回流，使2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮的酚巰基 被丁酸乙酯所取代，得到中間產(chǎn)物；隨后將該中間產(chǎn)物加入三氟乙酸中，回流反應(yīng)，脫去乙 基的保護(hù)，裸露出羧基，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的Irgacure 907的半抗原；再將其與N-羥 基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應(yīng)，與載體蛋白偶聯(lián)制備得到Irgacure 907特異性抗原； 所述載體蛋白為兔血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種； 2) 包被酶標(biāo)板： 將上述Irgacure 907特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個(gè)微孔內(nèi) Irgacure 907特異性抗原的濃度為0· 5-3. 0 μ g/mL ; 3) 制備Irgacure 907特異性抗體： 以步驟1)中得到的Irgacure 907特異性抗原作為免疫原對(duì)小鼠進(jìn)行免疫；免疫后， 取血清效價(jià)高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩 選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完全 佐劑腹腔注射進(jìn)行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng) 辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行腹水純化，得到純化的Irgacure 907單克隆抗體；制備濃度為 0· 5-3. 0 μ g/mL的Irgacure 907單克隆抗體工作液。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟1) 中，制備Irgacure 907特異性抗原的具體方法為： 將Immol的Irgacure 907溶解于20mL無(wú)水二氯甲燒中，反應(yīng)體系溫度控制在-5°C， 緩慢滴加 IOmL三溴化硼二氯甲烷溶液，恢復(fù)至室溫，反應(yīng)完全后在0°C冰水淬滅，抽濾得到 帶有酚巰基的2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮；將0. 8mmol2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙 酮和碳酸鉀分散于無(wú)水二甲基甲酰胺中，常溫?cái)嚢柘录尤隝. 52g 4-溴丁酸乙酯，加熱回流 3h，使2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮的酚巰基被丁酸乙酯所取代，得到中間產(chǎn)物；隨后將 中間產(chǎn)物加入過(guò)量三氟乙酸中，回流攪拌反應(yīng)lh，脫去乙基的保護(hù)，裸露出羧基，制得能夠 與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的Irgacure 907的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反 應(yīng)，與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備得到Irgacure 907特異性抗原。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于，步驟3) 中，制備Irgacure 907特異性抗體的具體方法為： 以步驟1)中得到的Irgacure 907特異性抗原作為免疫原對(duì)7-8周齡的Balb/c小鼠 進(jìn)行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐劑與Irgacure 907特異性抗原溶液乳化，抗原濃度為 lmg/mL，劑量為200 μ g/只，以后每次加強(qiáng)免疫使用不完全弗氏佐劑與Irgacure 907特異 性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔1周加強(qiáng)免疫一次，共免疫5-7 次，當(dāng)抗體效價(jià)不再升高時(shí)，進(jìn)行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐劑直接用Irgacure 907特異性抗原水溶液腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測(cè)血清效價(jià)后，取血清效價(jià) 高的小鼠，在無(wú)菌條件下，取其脾細(xì)胞按10:1的比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進(jìn)行細(xì)胞融合； 采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞 株；并于一周前采用不完全佐劑腹腔注射Balb/C小鼠進(jìn)行致敏，劑量為0. 5mL/只；將細(xì)胞 濃度為1. 2萬(wàn)/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為0. 5mL/只；接種雜交瘤 細(xì)胞7-10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次；存于4°C冰箱保存；經(jīng)辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行 腹水純化，得到純化的Irgacure 907單克隆抗體。9. 權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，主 要包括以下步驟： 1) 樣品前處理 準(zhǔn)確量取待測(cè)樣品，定量加入有機(jī)溶劑，提取后定量吸取或萃取上清液，吹干后加入與 水互溶的有機(jī)溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測(cè)液； 2) 檢測(cè) 采用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，向包被有Irgacure 907特異性抗原 的酶標(biāo)板中加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品檢測(cè)液，再加入Irgacure 907特異性抗體工作液，溫育后洗 板，加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行酶活性的放大，再次洗板，加入底物顯色劑、終止液，然后以酶標(biāo)儀測(cè) 定吸光度值； 3) 結(jié)果分析 以抑制率I %為縱坐標(biāo)，以Irgacure 907濃度的對(duì)數(shù)Ig [Irgacure 907]為橫坐標(biāo)，繪 制Irgacure 907競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線；將樣品的抑制率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀 出樣品所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣品中Irgacure 907的實(shí)際含量； 所沭抑制率計(jì)筧公式如下：其中：1 -抑制率 B一一樣品溶液的平均吸光度值 B0一一〇 μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值 Bn--參比空白對(duì)照平均吸光度值。10.根據(jù)權(quán)利要求9的Irgacure 907檢測(cè)試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟1)中， 所述有機(jī)溶劑為乙腈； 步驟2)中，采用權(quán)利要求5所述的試劑盒，檢測(cè)的具體方法為：首先用2 μ g/mL的 Irgacure 907特異性抗原包被96孔酶標(biāo)板，100 μ L/孔，放置于4 °C冰箱包被過(guò)夜，用 250 μ L/孔封閉液封閉后以洗滌液洗滌，并拍干；然后加入Irgacure 907標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣 品檢測(cè)液50 μ L，再加入濃度為2 μ g/mL的Irgacure 907特異性抗體工作液50 μ L，混合均 勻，37°C溫育Ih ;隨后洗滌拍干，加入以稀釋液按1:8000比例稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記 的羊抗鼠二抗工作液，100 μ L/孔，37°C溫育Ih ;最后洗滌拍干，每孔加入50 μ L顯色劑B、 10 μ L顯色劑Α，顯色15min，加入濃度為2mol/L的硫酸溶液，50 μ L/孔，終止反應(yīng)，設(shè)定酶 標(biāo)儀于450nm處，測(cè)定吸光度值。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種Irgacure？907檢測(cè)試劑盒及其制備和使用方法，屬于添加劑檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。該試劑盒包括每個(gè)微孔內(nèi)包被濃度為0.5-3.0μg/mL？Irgacure？907特異性抗原的酶標(biāo)板，濃度為0.5-3.0μg/mL的Irgacure？907特異性抗體工作液，且所述Irgacure？907特異性抗原與Irgacure？907特異性抗體的用量為1:1。本發(fā)明的試劑盒可以快速檢測(cè)Irgacure？907在紙質(zhì)包裝制品、液態(tài)食品模擬物、干性食品模擬物和飲料中的含量，具有特異性高，結(jié)果準(zhǔn)確且前處理簡(jiǎn)單，對(duì)儀器設(shè)備要求低、檢測(cè)成本低的特點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/53, G01N33/531
【公開(kāi)號(hào)】CN105067805
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510452064
【發(fā)明人】唐穗平, 劉付建, 王娜, 陳紀(jì)文, 陳滿英
【申請(qǐng)人】廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月28日