Irgacure 907檢測試劑盒及其制備和使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種添加劑檢測技術(shù)，特別是涉及一種Irgacure907檢測試劑盒及 其制備和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] Irgacure907,學(xué)名為2-甲基-1-(4-甲硫基）苯基2-嗎啉基-1-丙酮（2-Meth yl_4, - (methylthio)-2-morpholinopropiophenone，cas號為 71868-10-5)，是一種光引發(fā) 劑（Photoinitiators，PIs)〇
[0003] 隨著UV印刷工藝的普及，PIs作為紫外光固化油墨的主要成分被廣泛用于紙質(zhì)包 裝印刷，有助于引發(fā)或催化相應(yīng)的聚合反應(yīng)，提高紫外光油墨的固化干燥效率。但有研究表 明，UV印刷油墨固化完成后，其中殘留的PIs在一定條件下可以發(fā)生化學(xué)迀移，能夠穿過包 裝材料或者通過表面接觸污染包裝內(nèi)的食品，從而對人體的健康造成潛在的危害。因此，瑞 士、歐盟等國家和組織相繼頒布了法規(guī)和許可清單以限制食品接觸材料中PIs的使用，其 中規(guī)定Irgacure907的特定迀移量（SML)為0? 01mg/kg。
[0004] 因此，食品紙包裝材料、食品模擬物和紙包裝食品中PIs的檢測研究已成為研究 的熱點，但目前的檢測方法以色譜質(zhì)譜儀器方法為主，這些方法具有耗時較長、難以實現(xiàn)現(xiàn) 場檢測的缺陷，所以亟需一種合適的快速檢測Irgacure907的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 基于此，有必要針對上述問題，提供一種Irgacure907檢測試劑盒，該檢測試劑 盒以酶聯(lián)免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)，可以快速檢測Irgacure907的含量。
[0006] 一種Irgacure907檢測試劑盒，主要包括：
[0007] 1)包被Irgacure907特異性抗原的酶標(biāo)板：所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi)Irgacure 907特異性抗原的濃度為0. 5-3. 0yg/mL;
[0008] 2)Irgacure907特異性抗體工作液：該Irgacure907特異性抗體的濃度為 0. 5-3. 0yg/mL；
[0009] 所述Irgacure907特異性抗原與Irgacure907特異性抗體的用量比為1: 1。
[0010] 上述Irgacure907檢測試劑盒的檢測原理為：將Irgacure907特異性抗原吸附 于固相載體酶標(biāo)板上，加入待測樣品檢測液或Irgacure907標(biāo)準(zhǔn)溶液以及Irgacure907 特異性抗體工作液，使待測樣品中的Irgacure907和固相載體上包被的Irgacure907特 異性抗原競爭結(jié)合Irgacure907特異性抗體，孵育后，加入酶標(biāo)二抗進行酶活性的放大， 顯色后測定樣品的吸光度，該值與樣品中Irgacure907的量呈負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即 可得出Irgacure907濃度范圍。因而該試劑盒能夠快速檢測Irgacure907的含量。
[0011]在其中一個實施例中，該試劑盒還包括有酶標(biāo)二抗，所述酶標(biāo)二抗是濃度按 1:8000的比例稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。上述酶標(biāo)二抗具有最佳的酶活性 放大效果。
[0012] 在其中一個實施例中，所述Irgacure907特異性抗原為Irgacure907與載體蛋 白的偶聯(lián)物，該Irgacure907特異性抗原的濃度為2yg/mL;所述Irgacure907特異性抗 體為鼠源單克隆抗體，該Irgacure907特異性抗體的濃度為2yg/mL。選用上述種類和濃 度的抗原抗體，具有最佳反應(yīng)比例，酶聯(lián)免疫反應(yīng)最徹底，形成的免疫復(fù)合物沉淀最多、最 大。
[0013] 在其中一個實施例中，該試劑盒還包括Irgacure907標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色劑、 洗滌液、終止液、封閉液和濃縮樣品稀釋液。使檢測人員在使用該試劑盒時具有方便快捷的 優(yōu)點。
[0014] 在其中一個實施例中，所述載體蛋白為兔血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋 白、甲狀腺球蛋白中的一種；所述Irgacure907標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為IXIO3yg/L、 IXlO2yg/LUXlO1yg/L、lXl〇Vg/L、0.Iyg/L;所述底物顯色劑由顯色劑A和顯色劑B 組成，所述顯色劑A為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色劑B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；所 述洗滌液為含有0. 05 % -0. 5 %吐溫-20的0. 01M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液；所述終止液為 l-2mol/L的硫酸溶液；所述封閉液為含5%脫脂奶粉的0. 01M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液；所 述濃縮樣品稀釋液為〇. 01M，pH7. 5的磷酸鹽緩沖液；所述酶標(biāo)板的材料為聚苯乙烯、聚乙 烯、聚丙烯中的一種。
[0015] 本發(fā)明還公開了一種上述的Irgacure907檢測試劑盒的制備方法，主要包括以 下步驟：
[0016] 1)制備Irgacure907特異性抗原：
[0017] 將Irgacure907溶解于二氯甲烷中，反應(yīng)體系溫度控制在-KTC至_1°C，滴加三 溴化硼二氯甲烷后恢復(fù)至室溫，反應(yīng)完全后在〇°C冰水淬滅，抽濾得到帶有酚巰基的2-甲 基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮；將上述2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮和碳酸鉀分散于二甲 基甲酰胺中，加入4-溴丁酸乙酯，加熱回流，使2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮的酚巰基 被丁酸乙酯所取代，得到中間產(chǎn)物；隨后將該中間產(chǎn)物加入三氟乙酸中，回流反應(yīng)，脫去乙 基的保護，裸露出羧基，制得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的Irgacure907的半抗原；再將其與N-羥 基丁二酰胺和碳二亞胺混合后反應(yīng)，與載體蛋白偶聯(lián)制備得到Irgacure907特異性抗原； 所述載體蛋白為兔血清白蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白、甲狀腺球蛋白中的一種；
[0018] 2)包被酶標(biāo)板：
[0019] 將上述Irgacure907特異性抗原包被于酶標(biāo)板中，所述酶標(biāo)板的每個微孔內(nèi) Irgacure907特異性抗原的濃度為0? 5-3. 0yg/mL;
[0020] 3)制備Irgacure907特異性抗體：
[0021] 以步驟1)中得到的Irgacure907特異性抗原作為免疫原對小鼠進行免疫；免疫 后，取血清效價高的小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行細(xì)胞融合；采用有限稀釋 法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞株；并取不完 全佐劑腹腔注射進行致敏后的小鼠，將雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，收集腹水，經(jīng) 辛酸 -硫酸銨沉淀法進行腹水純化，得到純化的Irgacure907單克隆抗體；制備濃度為 0? 5-3. 0yg/mL的Irgacure907單克隆抗體工作液。
[0022] 采用上述方法制得的Irgacure907特異性抗原和特異性抗體，具有特異性好的 優(yōu)點。
[0023] 在其中一個實施例中，步驟1)中，制備Irgacure907特異性抗原的具體方法為：
[0024] 將Immo1的Irgacure907溶解于20mL無水二氯甲燒中，反應(yīng)體系溫度控制 在-5°C，緩慢滴加IOmL三溴化硼二氯甲烷溶液，恢復(fù)至室溫，反應(yīng)完全后在0°C冰水淬滅， 抽濾得到帶有酚巰基的2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮；將0. 8mm〇12-甲基-4-巰基-2-嗎 啉苯丙酮和碳酸鉀分散于無水二甲基甲酰胺中，常溫攪拌下加入I. 52g4-溴丁酸乙酯，加 熱回流3h，使2-甲基-4-巰基-2-嗎啉苯丙酮的酚巰基被丁酸乙酯所取代，得到中間產(chǎn)物； 隨后將中間產(chǎn)物加入過量三氟乙酸中，回流攪拌反應(yīng)lh，脫去乙基的保護，裸露出羧基，制 得能夠與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的Irgacure907的半抗原；再將其與N-羥基丁二酰胺和碳二亞胺混 合后反應(yīng)，與牛血清白蛋白偶聯(lián)制備得到Irgacure907特異性抗原。
[0025] 在其中一個實施例中，步驟3)中，制備Irgacure907特異性抗體的具體方法為：
[0026] 以步驟1)中得到的Irgacure907特異性抗原作為免疫原對7-8周齡的Balb/ c小鼠進行免疫，首次免疫使用完全弗氏佐劑與Irgacure907特異性抗原溶液乳化，抗原 濃度為lmg/mL，劑量為200yg/只，以后每次加強免疫使用不完全弗氏佐劑與Irgacure 907特異性抗原溶液乳化，劑量同初次免疫；初次免疫兩周后，每間隔1周加強免疫一次， 共免疫5-7次，當(dāng)抗體效價不再升高時，進行最后一次免疫；最后一次不加免疫佐劑直接用 Irgacure907特異性抗原水溶液腹腔注射，劑量同初次免疫；尾部取血檢測血清效價后， 取血清效價高的小鼠，在無菌條件下，取其脾細(xì)胞按10:1的比例與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0進行 細(xì)胞融合；采用有限稀釋法篩選雜交瘤細(xì)胞，得到完全同質(zhì)的單克隆抗體和穩(wěn)定的單克隆 雜交瘤細(xì)胞株；并于一周前采用不完全佐劑腹腔注射Balb/C小鼠進行致敏，劑量為0. 5mL/ 只；將細(xì)胞濃度為1. 2萬/mL的雜交瘤細(xì)胞混懸液注射到小鼠腹腔中，劑量為0. 5mL/只；接 種雜交瘤細(xì)胞7-10天后，收集腹水，反復(fù)收集數(shù)次；存于4°C冰箱保存；經(jīng)辛酸-硫酸銨沉 淀法進行腹水純化，得到純化的Irgacure907單克隆抗體。
[0027] 本發(fā)明還公開了一種上述的Irgacure907檢測試劑盒的使用方法，主要包括以 下步驟：
[0028] 1)樣品前處理
[0029] 準(zhǔn)確量取待測樣品，定量加入有機溶劑，提取后定量吸取或萃取上清液，吹干后加 入與水互溶的有機溶劑復(fù)溶，并以水稀釋定容，得到樣品檢測液；