用于快速檢測阪崎腸桿菌的納米免疫傳感器的制備方法及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于阪崎腸桿菌快速檢測的納米免疫傳感器的制備方法，以及利 用該納米免疫傳感器檢測奶粉中的阪崎腸桿菌的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 阪崎腸桿菌是一種常見的寄生在人和動物腸道內(nèi)的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，有周 生鞭毛、能運動、兼性厭氧，為腸道正常菌群之一。阪崎腸桿菌作為一種條件性致病菌，能導(dǎo) 致嚴(yán)重的新生兒童腦膜炎、小腸結(jié)腸炎和菌血癥。并且可以導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥甚至死亡， 死亡率高達(dá)50%以上。嬰幼兒奶粉作為攜帶阪崎腸桿菌的主要食品種類，近幾年來連續(xù)引 發(fā)了多起與食品安全相關(guān)的事件而備受國際相關(guān)組織，各國政府的高度重視和消費者的廣 泛關(guān)注。目前阪崎腸桿菌的分布及致病機制并不十分清楚，鑒于其潛在的危害，對于該菌的 檢測顯得尤為重要。傳統(tǒng)的阪崎腸桿菌檢測方法，依賴于生化和形態(tài)學(xué)特征，國際上通常 以美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA)和國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO)制定的檢測方法為標(biāo)準(zhǔn)方法。 2008年我國也制定了阪崎腸桿菌檢驗國家標(biāo)準(zhǔn)，并于2010年進(jìn)行了修訂，規(guī)范了阪崎腸桿 菌檢測。但傳統(tǒng)的檢測方法存在操作繁瑣、耗時長、不易分辨結(jié)果等缺點。因此，目前許多 工作研究者致力于開發(fā)更為快速、準(zhǔn)確的阪崎腸桿菌的檢測方法，以提高環(huán)境、食品阪崎腸 桿菌的檢測效率，同時要避免出現(xiàn)假陰性或假陽性的現(xiàn)象。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)的不足，提供一種用于快速檢測阪崎腸桿菌的納米免疫傳 感器的制備方法，還提供一種利用該免疫傳感器檢測食品中阪崎腸桿菌的方法，本發(fā)明方 法既具備了更加靈敏、快速、易微型化、便攜的優(yōu)勢，同時也具備了免疫反應(yīng)抗原-抗體結(jié) 合的特異性，所以，在致病性微生物的快速檢測中的應(yīng)用日益受到各國學(xué)者的重視。
[0004] 為解決以上問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0005] 本發(fā)明一種用于快速檢測阪崎腸桿菌的納米免疫傳感器的制備方法，其特征是， 以玻碳電極為基礎(chǔ)電極，以聚酰胺樹枝狀大分子材料結(jié)合還原性石墨烯納米復(fù)合物為電活 性修飾膜層，具體將該納米復(fù)合修飾物固定于玻碳電極表面，然后采用物理吸附法或采用 牛血清白蛋白一戊二醛交聯(lián)方法固定化辣根過氧化物酶標(biāo)記的阪崎腸桿菌抗體制備而成 納米免疫傳感器。
[0006] 所述的用于快速檢測阪崎腸桿菌的納米免疫傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0007] a?電極預(yù)處理
[0008] 將玻碳電極用氧化鋁拋光粉拋光打磨至鏡面后用蒸餾水清洗干凈，再依次用二次 去離子水、無水乙醇、二次去離子水超聲清洗3min~5min，用氮氣吹干玻碳電極，然后，將 pH值為7. 0的磷酸鹽緩沖液放入燒杯中，再加入鐵氰化鉀、氯化鉀和過氧化氫，使其濃度 分別為2mmol/L、0.lmol/L和0. 5mmol/L，得到電解質(zhì)溶液，然后將玻碳電極、Ag/AgCl參比 電極和鉑絲（片）對電極插入上述電解質(zhì)溶液中，連接PAR270電化學(xué)工作站；用PAR270 電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安法掃描處理，掃描速度為50mV?s\掃描電位范圍在-〇. 2V~ +0. 6V之間，持續(xù)掃描直到循環(huán)伏安圖穩(wěn)定之后，取出玻碳電極用二次蒸餾水清洗凈，用氮 氣吹干備用；
[0009] b.石墨烯-聚酰胺-胺復(fù)合物的制備
[0010] 將一定量的石墨稀粉末加入到二次蒸餾水中，使其濃度為0. 5mg/ml，攪拌Imin~ 2min，并超聲處理15min~20min，得到均勾一致的黑色石墨稀懸浮液，備用；
[0011] 將2. 0代聚酰胺-胺溶于體積濃度為1%的乙酸溶液中，使聚酰胺-胺的濃度為 I. 0X10 3g/mL，室溫的條件下，磁力攪拌55min~60min，得到聚酰胺-胺溶液，然后將聚酰 胺-胺溶液和上述的石墨烯懸浮液按體積比1:1混合均勻，將混合溶液超聲處理I. 5h~ 2h，得到均勻穩(wěn)定的石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物溶液；
[0012] c?免疫傳感器的制備
[0013] 準(zhǔn)確量取3~8y L步驟b得到的石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物溶液滴涂到步 驟a得到的玻碳電極表面，于室溫下自然晾干或用便攜式紅外干燥器烘干，然后在玻碳電 極表面滴涂與石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物同體積的辣根過氧化物酶標(biāo)記的阪崎腸桿菌 抗體，并置于4°C冰箱內(nèi)反應(yīng)I. 5h~2h，再滴涂同體積的lwt%牛血清白蛋白溶液于37°C 溫度下處理55min~60min封閉非特異性吸附位點，將修飾后的電極取出，用二次去離子水 沖洗去除未結(jié)合的多余辣根過氧化物酶標(biāo)記的阪崎腸桿菌抗體，得到阪崎腸桿菌納米免疫 傳感器，在4°C避光的條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0014] 所述的用于快速檢測阪崎腸桿菌的納米免疫傳感器的制備方法，所述步驟c中量 取的步驟b得到的石墨烯-聚酰胺-胺納米復(fù)合物溶液為5yL。
[0015] 上述的納米免疫傳感器檢測阪崎腸桿菌的方法，包括以下具體步驟；
[0016] 取分離純化的阪崎腸桿菌加入到8. 5g/L的生理鹽水中，在37°C搖床中過夜培養(yǎng)， 使得阪崎腸桿菌均勻分散在生理鹽水中，然后依次將其阪崎腸桿菌用濃度為8. 5g/L的生 理鹽水稀釋至阪崎腸桿菌菌懸液的濃度為108(311/1]11、10 6(311/1]11、104(311/1]11、和102(311/1]11，以及 8. 5g/L的生理鹽水，備用；在所述納米免疫傳感器上滴涂與辣根過氧化物酶標(biāo)記的阪崎腸 桿菌抗體同體積的各個梯度的上述阪崎腸桿菌菌懸液，室溫下孵育20min~25min。以Ag/ AgCl電極為參比電極，鉑絲（片）為對電極，阪崎腸桿菌免疫傳感器為工作電極，組成三電 極測試系統(tǒng)，在與所述步驟a中的電解質(zhì)溶液相同的溶液中進(jìn)行電化學(xué)測試，用差分脈沖 伏安法進(jìn)行掃描處理，掃描速度為50mV?s\電壓范圍為-0. 2V~+0. 6V，以電流響應(yīng)值為 縱坐標(biāo)，阪崎腸桿菌的濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)，得到阪崎腸桿菌的免疫響應(yīng)電流值與其濃度之 間的線性曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性回歸方程式，實驗在25°C±0. 5°C下進(jìn)行；
[0017] 然后將檢測食品樣品奶粉加入到45°c±rc的緩沖蛋白胨水中，所述奶粉與緩沖 蛋白胨水的比例為Ig:9ml，搖動或攪拌至樣品充分溶解，于36°C±1°C培養(yǎng)18h~22h，得 到培養(yǎng)液一，移取培養(yǎng)液一轉(zhuǎn)接種于改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯中，培養(yǎng)液一與改良 月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯的體積比為1:10,36°C±1°C培養(yǎng)18h~22h，得到培養(yǎng)液二， 備用；所述的納米免疫傳感器上滴涂與辣根過氧化物酶標(biāo)記的阪崎腸桿菌抗體同體積的上 述備用的培養(yǎng)液二，室溫下孵育20min~25min。以Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲（片） 為對電極，阪崎腸桿菌免疫傳感器為工作電極，組成三電極測試系統(tǒng)，在與所述步驟a中的 電解質(zhì)溶液相同的溶液中進(jìn)行電化學(xué)測試，用差分脈沖伏安法進(jìn)行掃描處理，掃描速度為 50mV?s\電壓范圍為-0. 2V~+0. 6V，可以根據(jù)響應(yīng)電流值相比于免疫傳感器的響應(yīng)電流 值大幅下降，來判斷樣品中有阪崎腸桿菌，并且將樣品進(jìn)行三次測量，并求其平均值，按線 性回歸方程式計算樣品中阪崎腸桿菌的濃度，此過程在25°C±0. 5°C下進(jìn)行。
[0018] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下顯著的優(yōu)點：
[0019] ①本發(fā)明的免疫傳感器用于檢測奶粉中的阪崎腸桿菌法與國標(biāo)法和實時熒光PCR 法相比，在檢驗時間上大大縮短了，提尚檢測效率。
[0020] ②制備簡單、成本較低等優(yōu)點，降低了檢驗成本，也就是減少了生產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0021] 圖1為不同修飾情況的傳感器的循環(huán)伏安表征圖。
[0022] 圖2為基于石墨烯-聚酰胺-胺復(fù)合物的電化學(xué)免疫傳感器用于奶粉樣品I中阪 崎腸桿菌檢測的響應(yīng)電流圖。
[0023]圖3為奶粉樣品II中阪崎腸桿菌檢測的差分脈沖伏安圖
[0024]圖4為奶粉樣品III中阪崎腸桿菌檢測的差分脈沖伏安圖
【具體實施方式】
[0025] 下面參照附圖對本發(fā)明【具體實施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0026] 參見圖1、圖2、圖3、圖4。
[0027] 實施例1
[0028] 用免疫傳感檢測奶粉樣品I中阪崎腸桿菌
[0029] 1?免疫傳感器的制備
[0030