專利名稱：阪崎腸桿菌檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，以及用于該方法的阪崎腸桿菌金標(biāo) 快速診斷試劑盒和其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，世界范圍重大食品安全事件頻頻發(fā)生，瘋牛病、葡萄球菌腸毒素牛奶中 毒、蘇丹虹、二惡英、三聚氰胺等事件對(duì)全球經(jīng)濟(jì)和社會(huì)政局穩(wěn)定造成巨大影響。在諸多食 品安全實(shí)踐中，嬰幼兒奶粉中阪崎腸桿菌污染備受關(guān)注。阪崎腸桿菌(E. sakazakii)是近年來從奶粉(乳)制品中發(fā)現(xiàn)的、在一定條件下 可使人致病的一種食源性致病菌，屬于腸桿菌屬腸桿菌科的一種周生鞭毛、能運(yùn)動(dòng)的革蘭 氏陰性無芽孢桿菌，1980年由黃色陰溝菌更名為阪崎腸桿菌。阪崎腸桿菌是腸道正常菌群 的一種，在一定條件下可引起人和動(dòng)物致病。阪崎腸桿菌在自然界的污染來源尚不清楚，但它在食品中分布較廣泛，主要危害 對(duì)象是嬰兒，尤其是新生兒、早產(chǎn)兒、低出生體重兒或免疫力低下新生兒，可引起嚴(yán)重的菌 血癥、腦膜炎、小腸結(jié)腸炎、造成嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥和死亡，感染死亡率高達(dá)20-50%， 在某些情況下可達(dá)40-80%。2004年世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織經(jīng)過風(fēng)險(xiǎn)性評(píng)估將阪崎 腸桿菌和沙門氏菌共同列為嬰幼兒配方奶粉A類致病菌。世界糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織通報(bào)，在不同地區(qū)，嬰幼兒配方奶粉中阪崎腸桿菌 檢出率在2-22. 7%之間。因此，食源性阪崎腸桿菌污染已引起各國政府高度關(guān)注，加強(qiáng)了乳 品生產(chǎn)及進(jìn)出口環(huán)節(jié)檢測(cè)，國外乳業(yè)巨頭所生產(chǎn)產(chǎn)品曾因檢出阪崎腸桿菌而被召回。阪崎 腸桿菌的生物學(xué)特征和檢測(cè)檢驗(yàn)技術(shù)已成為學(xué)術(shù)界、政府和企業(yè)關(guān)注的熱點(diǎn)，已建立了實(shí) 時(shí)熒光定量PCR技術(shù)國際通用檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，我國于2005年由中國檢驗(yàn)檢疫研究院和天津檢疫 檢驗(yàn)局牽頭完成了《奶粉中阪崎腸桿菌檢測(cè)方法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，并已實(shí)施。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)具有熒光定量PCR反應(yīng)過程實(shí)時(shí)檢測(cè)、熒光定量重復(fù)性好、基因分析穩(wěn)定性好、熒光檢 測(cè)濃度梯度實(shí)驗(yàn)性范圍寬、熱循環(huán)升溫快速、熒光定量在對(duì)數(shù)期進(jìn)行定量分析等優(yōu)勢(shì)。其檢 測(cè)林敏度高、特異性強(qiáng)。但該方法還存在檢測(cè)設(shè)備昂貴、操作技術(shù)要求高、樣本污染易造成 假陽性等不足。目前檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法主要是通過常規(guī)生化鑒定、血清學(xué)檢測(cè)和PCR測(cè)定法。國際檢測(cè)阪崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)生化方法是美國食品和藥品管理局(FDA)的檢測(cè)方 法，對(duì)嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌分離與計(jì)數(shù)，用“三管法”增菌可檢測(cè)樣品中微量的阪崎 腸桿菌并定量，檢測(cè)時(shí)至少需要333g樣品。我國目前尚無該菌檢測(cè)方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，只有 行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。其中改進(jìn)的傳統(tǒng)方法與FDA方法比較，檢測(cè)結(jié)果一致，但效率大大提高，時(shí)間縮 短了 1/3 1/2。盡管如此，常規(guī)檢測(cè)方法仍存在耗時(shí)較長，對(duì)檢驗(yàn)員的要求較高，假陰性較 高的弊端。血清學(xué)檢測(cè)成本低廉，易于操作，制備多克隆抗體可用于輔助常規(guī)生化檢測(cè)，快速進(jìn)行中毒診斷。我國國家標(biāo)準(zhǔn)目前仍然使用血清學(xué)鑒定的方法用于沙門氏菌、志賀氏菌的 分型。血清學(xué)檢測(cè)的缺點(diǎn)是易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不適合作為獨(dú)立的檢測(cè)方法應(yīng)用。分子生物學(xué)尤其是PCR技術(shù)的發(fā)展給阪崎腸桿菌的快速檢測(cè)提供了廣闊的空間。 除了普通PCR方法和熒光PCR方法，還有依據(jù)該菌生理生化特征建立的分子檢測(cè)方法。隨 機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、脈沖電場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)、染色體DNA分析、核糖核酸分型以及 質(zhì)粒分型等也都已用于對(duì)阪崎腸桿菌分型研究。但PCR法檢測(cè)費(fèi)用昂貴，對(duì)儀器設(shè)備及檢 測(cè)環(huán)境的要求很高。阪崎腸桿菌感染具有發(fā)病急，致死率高等特點(diǎn)，同時(shí)該菌的自然來源非常廣泛，并 且目前對(duì)其致病機(jī)制還不是很清楚，雖然近年來相關(guān)檢測(cè)技術(shù)取得了很大的進(jìn)展，但仍然 存在一些缺陷。所以，進(jìn)一步研究該菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法對(duì)食源性致病菌感染 的控制、疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查非常關(guān)鍵。本發(fā)明采用阪崎腸桿菌免疫家兔或羊制備多表位抗體，免疫BALB/c小鼠制備單 克隆抗體，研制一種可適用于現(xiàn)場(chǎng)操作的金標(biāo)快速診斷試劑盒，本試劑盒可特異性的檢測(cè) 阪崎腸桿菌，檢測(cè)快速(5-20分鐘出結(jié)果)，可用于發(fā)病現(xiàn)場(chǎng)快速診斷。本發(fā)明的公開本發(fā)明的第一目的是提供一種阪崎腸桿菌的檢測(cè)方法，該方法為一步檢測(cè)法，靈 敏度高、特異性強(qiáng)，而且反應(yīng)速度快、操作簡便，無需專門設(shè)備，適用于臨床檢測(cè)、流行病學(xué) 調(diào)查和場(chǎng)地檢疫等多種場(chǎng)合。本發(fā)明的第二目的是提供一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒，是針對(duì)阪崎腸 桿菌檢測(cè)提供的一種簡便而且直接的一步法檢測(cè)試劑盒，利用該試劑盒檢測(cè)阪崎腸桿菌的 靈敏度高、特異性強(qiáng)，速度快、操作簡便，無需專門設(shè)施。本發(fā)明的第三目的是提供一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，該 方法簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。本發(fā)明的第一目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種阪崎腸桿菌檢測(cè)方法包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗阪崎腸桿菌抗體 載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測(cè)載體上包被抗阪崎 腸桿菌抗體形成的檢測(cè)線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠 體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制 線雙線，顯雙線結(jié)果判定為陽性，僅控制線顯色，結(jié)果判定為陰性。本發(fā)明的第二目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)阪崎腸桿菌金標(biāo)檢測(cè)卡組成。檢測(cè)卡由檢測(cè)條和塑料卡盒組成，檢測(cè)條安裝在塑料卡內(nèi)。所述的阪崎腸桿菌金 標(biāo)檢測(cè)條是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層和加樣端吸水 層之間設(shè)有金標(biāo)阪崎腸桿菌抗體層，在檢測(cè)層上包被有由抗阪崎腸桿菌單抗形成的檢測(cè)線 和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。本發(fā)明的第三目的可通過如下措施來實(shí)現(xiàn)一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層和檢 測(cè)層的控制線，檢測(cè)線的包被，然后再襯板上組合阪崎腸桿菌金標(biāo)測(cè)試條和檢測(cè)板。所述的金標(biāo)抗體層的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，在濃度為0. 005-0. 012%的氯金酸中加入其體積的1. 3-2%、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸10-20 分鐘，可得到15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗阪崎腸桿菌抗體，在膠體金溶液中 用0. 2M碳酸鉀溶液調(diào)pH7. 6-8. 6，按2-8mg/100ml加入阪崎腸桿菌抗體，攪拌后，再在溶液 中按0. 1-0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4°C靜置2_4小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀物，得上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60-80 分鐘離心得沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml溶于0. 02M、pH7. 4Tris-HCI緩沖液得膠體 金溶液，該緩沖液中含0. 2-0. 6%的動(dòng)物血清蛋白和0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi將膠體金溶液 浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止，37°C干燥過夜形成金標(biāo)抗體層。所述的檢測(cè) 層的制備是在纖維素膜上設(shè)有阪崎腸桿菌抗體構(gòu)成的檢測(cè)線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成 的控制線。其制備方法是濃度為l_2mg/ml的或抗體溶液中加入的固定劑，再利用噴 膜機(jī)將抗體噴在纖維素膜上，噴膜后37°C干燥，再用0. 01mlpH7. 0含10%小牛血清的PBS， 在37°C下封閉30分鐘，0. 01mlpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。所述的固定劑選用甲醛、丙酮中的一種。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明檢測(cè)、診斷阪崎腸桿菌的方法為一步法，具有較高的特異性和靈敏性，且 操作簡便，無需專門設(shè)施。2、本發(fā)明的診斷試劑盒檢測(cè)阪崎腸桿菌時(shí)具有較高的特異性和靈敏性，檢測(cè)過程 操作迅速、快捷、方便，適用于臨床檢驗(yàn)、流行病學(xué)調(diào)查和場(chǎng)地檢疫等多種場(chǎng)合。3、本發(fā)明的診斷試劑盒的制備方法簡便、穩(wěn)定性好、重復(fù)性好。圖面說明

圖1是發(fā)明檢測(cè)板的外觀結(jié)構(gòu)示意圖1-檢測(cè)板 2-加樣孔 3-檢視窗圖2是本發(fā)明檢測(cè)板的內(nèi)部結(jié)構(gòu)示意圖4-加樣端吸水層 5-金標(biāo)抗體層 6-控制線 7-檢測(cè)線8-檢測(cè)層 9-吸水端吸水層 10-襯板本發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明還將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例一一種阪崎腸桿菌檢測(cè)方法包括下述步驟(1)將膠體金標(biāo)記的抗阪崎腸桿菌抗體 載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測(cè)載體上包被阪崎腸 桿菌抗體形成的檢測(cè)線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取樣品稀釋液滴于膠 體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線、控制 線雙線，顯雙線結(jié)果判定為陽性，僅控制線顯色結(jié)果判定為陰性。參照?qǐng)D1，一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒內(nèi)設(shè)阪崎腸桿菌金標(biāo)檢測(cè)卡1。參照?qǐng)D2，所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)檢測(cè)卡1是在襯板10上設(shè)有加樣端吸水層4、檢 測(cè)層8和吸水端吸水層9，在檢測(cè)層和加樣端吸水層4之間設(shè)有金標(biāo)阪崎腸桿菌抗體層5， 在檢測(cè)層8上包被有檢測(cè)線7和控制線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層 濾紙制成；檢測(cè)層8為纖維素膜，該纖維素膜可為硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜；金標(biāo)抗體 層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標(biāo)記抗體制成。
一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法主要包括制備金標(biāo)抗體層(5) 和檢測(cè)層(8)的質(zhì)控線(6)、檢測(cè)線(7)的包被，然后再襯板(10)上組合阪崎腸桿菌金標(biāo)測(cè) 試條和檢測(cè)卡(1)。在塑料墊板10的兩端分別粘貼加樣端吸水層4和吸水端吸水層9 ；在 其中段粘貼包被檢測(cè)線和控制線的纖維素膜層8，在加樣端吸水層4與纖維素膜層8的交接 部位，夾貼含金標(biāo)抗體層5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5 部分在纖維素膜層8上。然后按4毫米寬、8厘米長規(guī)格切條，在組裝于塑料盒內(nèi)。盒蓋上 加樣孔2正對(duì)測(cè)試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對(duì)纖維素膜的檢測(cè)層8。所述的金標(biāo)抗體層5的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，取IOOmg氯金 酸溶于IOOOml三蒸水中，加入15ml、濃度為的檸檬酸三鈉，煮沸15分鐘，冷卻后得到 15-50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記阪崎腸桿菌抗體，取IOOml膠體金溶液，用0. 2ml 碳酸鉀溶液調(diào)PH8. 4，加入6mg阪崎腸桿菌抗體，攪拌20分鐘，再加入MOmg牛血清白蛋白， 繼續(xù)攪拌5分鐘，4°C靜置2-4小時(shí)；iii將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘， 棄沉淀物，收集上清液；iv將上清液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60分鐘離心收集沉淀物；ν將 沉淀物按^iVlOOml溶于0. 02M、pH7. 4的Tris-HCI緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含 0. 25%的牛血清白蛋白和0. 02%疊氮鈉；vi將膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體 開始滲出為止，在37°C下2小時(shí)干燥而形成金標(biāo)抗體層5。所述膠體金標(biāo)記抗體為羊、兔抗 阪崎腸桿菌抗體。所述的檢測(cè)層8是在硝酸纖維素膜上設(shè)有阪崎腸桿菌抗體構(gòu)成的檢測(cè)線7和由 羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線6。其制備方法是取抗阪崎腸桿菌抗體，調(diào)濃度為Img/ ml，加入2 %的甲醛，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段噴檢測(cè)線7 ；再取羊或兔抗鼠IgG調(diào)濃度 為2mg/ml，加入2%的甲醛，用噴膜機(jī)在纖維素膜中段，距檢測(cè)線0. 5cm處，噴控制線6，按 20ul/10cm設(shè)置噴膜量，噴膜37°C干燥，2小時(shí)，再用0. 01MpH7. 0含10%小牛血清的PBS，在 37°C下封閉30分鐘，0. 01MpH7. 0的PBS漂洗，37 °C干燥。實(shí)施例二 阪崎腸桿菌檢測(cè)方法及其金標(biāo)快速診斷試劑盒與例一同。該試劑盒的制備方法除制備膠體金標(biāo)記的抗體為抗阪崎腸桿菌單克隆抗體外，其 他條件與例一同。
權(quán)利要求
1.一種阪崎腸桿菌檢測(cè)方法，其特征在于(1)將膠體金標(biāo)記的阪崎腸桿菌抗體載于 玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測(cè)載體上包被抗阪崎腸桿 菌抗體(多抗或單抗)形成的檢測(cè)線和由羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；( 取檢測(cè) 樣本稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌，則在檢測(cè)載體 上形成檢測(cè)線和控制線雙線，顯雙線結(jié)果判定為陽性，僅控制線顯色結(jié)果判定為陰性。
2.一種阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒內(nèi)設(shè)阪崎腸桿菌金標(biāo)檢 測(cè)卡，檢測(cè)卡由檢測(cè)條和塑料卡盒組成，檢測(cè)條安裝在塑料卡盒內(nèi)。
3.如權(quán)利要求2所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑卡，其特征在于所述的阪崎腸 桿菌金標(biāo)檢測(cè)卡⑴是在襯板(10)上設(shè)有加樣端吸水層G)、檢測(cè)層⑶和吸水端吸水層 (9)，在檢測(cè)層⑶和加樣端吸水層⑷之間設(shè)有金標(biāo)阪崎腸桿菌抗體層(5)，在檢測(cè)層⑶ 上包被有檢測(cè)線(7)和控制線(6)。
4.如權(quán)利要求2所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于制備 金標(biāo)抗體層( 和檢測(cè)層(8)的控制線(6)、檢測(cè)線(7)的包被，然后在襯板(10)上組合阪 崎腸桿菌金標(biāo)測(cè)試條和檢測(cè)卡(1)。
5.如權(quán)利要求4所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的金標(biāo)抗體層(5)的制備方法包括下述步驟i膠體金的制備，在濃度為0. 004 0. 012% 的氯金酸中加入其體積的1. 3 2%，濃度為1 3%的檸檬酸三鈉，煮沸10 20分鐘， 可得到15 50納米的膠體金溶液；ii膠體金標(biāo)記抗阪崎桿菌單克隆抗體，在膠體金溶 液中用0. 2m碳酸鉀溶液調(diào)pH8. 0 8. 4，按4 12mg/100ml加入抗人阪崎桿菌單克隆抗 體，攪拌后，再在溶液中按0. 1 0. 6g/100ml加入動(dòng)物血清蛋白，4°C靜置2_4小時(shí)；iii 將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉(zhuǎn)/分鐘離心10 15分鐘，棄沉淀物，得上清液；iv將上清 液經(jīng)10000轉(zhuǎn)/分鐘離心60 80分鐘離心得沉淀物；ν將沉淀物按4-10ml/100ml溶于 0. 02M、pH7. 4Tris-HCI緩沖液得膠體金溶液，該緩沖液中含0. 2-0. 6 %的動(dòng)物血清蛋白和 0. 01-0. 06%疊氮鈉；vi將上述膠體金溶液浸入玻璃纖維或無紡布至液體開始滲出為止， 37°C干燥過濾形成金標(biāo)抗體層。
6.如權(quán)利要求4或5所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于 所述膠體金標(biāo)記抗體為羊或兔抗阪崎腸桿菌抗體或阪崎腸桿菌單克隆抗體。
7.如權(quán)利要求4所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的檢測(cè)層(8)是在纖維素膜上設(shè)有羊或兔抗阪崎腸桿菌抗體或阪崎腸桿菌單克隆抗體構(gòu) 成的檢測(cè)線(7)和由抗羊或兔抗鼠IgG抗體形成的控制線(6)。
8.如權(quán)利要求7所述的阪崎腸桿菌金標(biāo)快速診斷試劑盒的制備方法，其特征在于所述 的固定劑為甲醛或丙酮。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法，以及用于該方法的金標(biāo)快速診斷試劑盒和其制備方法，其檢測(cè)方法包括(1)將膠體金標(biāo)記的抗阪崎腸桿菌抗體載于玻璃纖維或無紡布載體上，并在與膠體金標(biāo)記抗體載體相連的檢測(cè)載體上包被抗阪崎腸桿菌抗體形成的檢測(cè)線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線；(2)取樣品稀釋液滴于膠體金標(biāo)記抗體的載體上，如上述稀釋液含有阪崎腸桿菌，則在檢測(cè)載體上形成檢測(cè)線和控制線雙線，結(jié)果判定為陽性；僅控制線顯色，結(jié)果判定為陰性。該試劑盒由檢測(cè)卡組成，檢測(cè)卡由檢測(cè)條和塑料卡盒組成，檢測(cè)條安裝在塑料卡內(nèi)，檢測(cè)條是在襯板上設(shè)有加樣端吸水層、檢測(cè)層和吸水端吸水層，在檢測(cè)層和加樣端吸水層之間設(shè)有金標(biāo)阪崎腸桿菌抗體層，在檢測(cè)層上包被有由抗阪崎腸桿菌單抗形成的檢測(cè)線和由羊、兔抗鼠IgG抗體形成的控制線。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102135541SQ201010272890
公開日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2010年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月3日
發(fā)明者周海飛, 張遠(yuǎn)興, 李克生, 李志遠(yuǎn), 杜惠芬, 鄭悅, 馬國榮 申請(qǐng)人:李克生