懸浮電極微孔板電化學(xué)發(fā)光檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及在生物檢測技術(shù)領(lǐng)域中使用的一種可以在微孔板底部固定探針并使用懸浮電極的電化學(xué)發(fā)光檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]自然界的分子發(fā)光現(xiàn)象通常包括磷光、熒光、和化學(xué)發(fā)光三種類型。磷光和熒光屬于光致發(fā)光，需要激發(fā)光對發(fā)光體進(jìn)行照射然后產(chǎn)生磷光或熒光。化學(xué)發(fā)光原理則不同。在化學(xué)發(fā)光反應(yīng)過程中，分子由于吸收了化學(xué)反應(yīng)所釋放的能量而產(chǎn)生所謂“能量躍迀”，由基態(tài)轉(zhuǎn)化為不穩(wěn)定的激發(fā)態(tài)。當(dāng)分子從激發(fā)態(tài)重新衰變成基態(tài)時釋放出光子即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象。電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence)是在電化學(xué)反應(yīng)中產(chǎn)生的一種化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象，也可以說電化學(xué)發(fā)光是利用電化學(xué)方法促進(jìn)或控制化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)物。
[0003]電化學(xué)發(fā)光研宄始于上世紀(jì)三十年代。1929年Harvey等發(fā)現(xiàn)在堿性條件下電解魯米諾時可在電極上產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，此后相關(guān)研宄陸續(xù)開展。1963年Kuwana等開展了魯米諾的電化學(xué)動力學(xué)和發(fā)光機(jī)理的研宄，隨后，伴隨著光電技術(shù)的進(jìn)展，由于弱光檢測的增強(qiáng)使得其它方式的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)也相繼被揭示。上世紀(jì)八十年代吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系的出現(xiàn)是該領(lǐng)域一個重大進(jìn)展。此后電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)開始在免疫分析、核酸分析中得到有效應(yīng)用。
[0004]吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系中最常用的是三丙胺-吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系。三丙胺-吡啶釕電化學(xué)發(fā)光體系的工作原理如下:化學(xué)發(fā)光劑三聯(lián)吡啶釕[Ru(bpy)3]2 +和電子供體三丙胺(TPA)在陽極表面分別被氧化成[Ru (bpy) 3]3 +和TPA +.。TPA+.很不穩(wěn)定，很容易失去一個質(zhì)子(H+)而形成強(qiáng)還原劑TPA.。當(dāng)[Ru (bpy) 3]3+和TPA.發(fā)生氧化還原反應(yīng)時，[Ru (bpy) 3]3+被TPA.還原形成激發(fā)態(tài)的二價[Ru (bpy) 3]2+.，TPA.被氧化成二丙胺和丙醛。接著激發(fā)態(tài)的[Ru(bpy)3]2+.衰減成基態(tài)的[Ru(bpy)3]2+，同時發(fā)射一個波長為614nm的光子。在三丙胺-卩比啶iI了電化學(xué)發(fā)光體系中，發(fā)光分子三聯(lián)卩比啶1 了在電極表面周而復(fù)始地進(jìn)行基態(tài)-激發(fā)態(tài)-基態(tài)的能量轉(zhuǎn)移，產(chǎn)生大量光子。
[0005]電化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)具有靈敏度高、線性范圍廣的特點。上世紀(jì)八十年代開始廣泛使用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)至今依然是最常用的生物、醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)之一，與酶聯(lián)免疫吸附試驗相比，電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)的檢測靈敏度和線性范圍至少可以提高兩個數(shù)量級。此外，電化學(xué)發(fā)光分析技術(shù)且具有試劑穩(wěn)定、可控性強(qiáng)等優(yōu)點。近年來，電化學(xué)發(fā)光在生物、醫(yī)學(xué)分析中的應(yīng)用引起人們極大的研宄興趣。
[0006]目前最常用的電化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備主要有磁珠捕獲法和電極捕獲法兩類:磁珠捕獲法以磁珠為探針載體，磁珠捕獲待檢目標(biāo)分子-電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物復(fù)合物后，利用磁吸附原理將被捕獲的目標(biāo)分子和與之結(jié)合的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物固定到反應(yīng)電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號；電極捕獲法是直接將探針固化在反應(yīng)電極表面，從而使反應(yīng)電極直接捕獲與電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物相結(jié)合的待檢目標(biāo)分子，在電極作用下促使電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生光信號。
[0007]磁珠捕獲法由羅氏公司獲得反應(yīng)池電極材料等相關(guān)專利保護(hù)，并且要求采購復(fù)雜的檢測設(shè)備和非常昂貴的試劑，因此限制了其應(yīng)用范圍。電極捕獲法在國內(nèi)有較多研宄和應(yīng)用，最常見的電極制備方式包括使用金、銀、碳等導(dǎo)電材質(zhì)，將具有生物相容性的導(dǎo)電材料以等離子濺射、電漿絲印、或電鍍等方式固定在微孔反應(yīng)板底部構(gòu)成反應(yīng)電極。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種可以在微孔板底部固定探針并使用懸浮電極的電化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備，其具有設(shè)備制作簡單、耗材成本低、操作方便、檢測結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點，可以充分發(fā)揮電化學(xué)發(fā)光檢測方法靈敏度高、線性范圍廣、試劑穩(wěn)定的優(yōu)勢。
[0009]本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:采用底部透明的標(biāo)準(zhǔn)化尺寸微孔板，并將捕獲探針通過物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式固定在微孔板的反應(yīng)孔底部。采用懸浮電極結(jié)構(gòu)，將反應(yīng)電極(圖1 (I))從上部插入微孔板(圖1 (2))反應(yīng)孔，使反應(yīng)電極(圖1 (I))直接接觸固定有捕獲探針的反應(yīng)孔底部。當(dāng)固定在反應(yīng)孔底部的捕獲探針捕捉住待檢目標(biāo)分子-電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物復(fù)合物時，電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系在反應(yīng)電極表面進(jìn)行電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)產(chǎn)生光信號。所產(chǎn)生的光信號由位于微孔板(圖1 (2))底部的光電倍增管(PMT)(圖1 (3))檢測。
[0010]所述的微孔板包括:標(biāo)準(zhǔn)化尺寸的8孔或12孔條板；標(biāo)準(zhǔn)化尺寸的48孔、96孔或384孔微孔板。
[0011]所述的捕獲探針分子包括:生物素、親和素、捕獲抗體、肽核酸(P印tide NucleicAcid)探針或核酸探針。其中核酸探針包括基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針、cRNA探針以及寡核苷酸探針。
[0012]所述的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾及其衍生物或三聯(lián)吡啶釕衍生物。
[0013]所述的電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)體系包括:魯米諾體系、吡啶釕體系。魯米諾體系中電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為魯米諾及其衍生物，緩沖溶液含:1.0 mM — 3.0 mM H2O2,0.05 MNa2CO3-NaHCO3, pH 8 — 11。吡啶釕體系中電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物為三聯(lián)吡啶釕衍生物，緩沖溶液含:0.03 mM — 2.0 mM 二丁基乙醇胺(DBAE)，0.05 M 磷酸緩沖液，pH 6 — 9。
[0014]本發(fā)明的原理如下:現(xiàn)行電化學(xué)發(fā)光檢測設(shè)備中，反應(yīng)電極與電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物接觸作用的主要方式有兩類:一種是將捕獲探針固化磁珠上，通過磁珠捕獲被標(biāo)記了電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的目標(biāo)分子，然后通過電磁力將磁珠吸附到反應(yīng)電極表面，使電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物在反應(yīng)電極表面進(jìn)行電至氧化-還原反應(yīng)；另一種是將捕獲探針固化在反應(yīng)電極表面直接捕獲被標(biāo)記了電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的目標(biāo)分子，然后在反應(yīng)電極表面進(jìn)行電至氧化-還原反應(yīng)。本發(fā)明采用懸浮電極結(jié)構(gòu)，將捕獲探針通過物理吸附或化學(xué)偶聯(lián)方式固定在微孔板的反應(yīng)孔底部，從上部插入反應(yīng)孔的懸浮式電極緊密接觸固定在反應(yīng)孔底部的捕獲探針以及被標(biāo)記了電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物的目標(biāo)分子，使電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物在反應(yīng)電極表面進(jìn)行電至氧化-還原反應(yīng)，進(jìn)而通過“躍迀-衰變”過程發(fā)光。
[0015]對于磁珠捕獲法，由于磁珠在反應(yīng)電極表面排列的無序性，大部分電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物會被遮蓋在磁珠表面之間或背向電極的位置而無法參與電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，同時，由于磁珠本身會吸收光信號，從而導(dǎo)致產(chǎn)生的有效光信號降低。并且磁珠捕獲法設(shè)備構(gòu)造相對復(fù)雜，試劑成本高，不利于應(yīng)用推廣。對于電極直接捕獲法，需要在反應(yīng)池或反應(yīng)孔中制備電極，成本高且穩(wěn)定性難以控制。
[0016]本發(fā)明這種設(shè)計的優(yōu)點是:首先，探針在反應(yīng)孔底部排列密度大、有序性好，有利于被捕獲的目標(biāo)分子充分與反應(yīng)電極接觸。其次，可單獨重復(fù)使用昂貴的懸浮式電極，而對于已被污染的反應(yīng)孔則不必重復(fù)使用，既簡化了操作，又提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。第三，這種設(shè)計相對而言結(jié)構(gòu)更簡單，不必使用帶電極的反應(yīng)池或反應(yīng)孔，使得使用成本大大降低。第四，采用標(biāo)準(zhǔn)化尺寸的微孔反應(yīng)板，易于實驗室使用。
【附圖說明】
[0017]圖1是反應(yīng)電極⑴和微孔板(2)以及光電倍增管(3)的相對位置示意圖。
【具體實施方式】
[0018]具體實施例一
鎳鈦合金絲懸浮電極制備要求:采用0.02 — 0.8毫米溫度記憶鎳鈦合金絲懸浮電極(以下簡稱鎳鈦電極)，鎳鈦電極引腳鍍銀或不鍍銀，采用焊接或機(jī)械緊固方式固定在電極電路板上。每個電極電路板上固定8 — 384個鎳鈦電極(與使用的微孔板孔數(shù)相對應(yīng))。鎳鈦電極頂端呈截錐螺旋狀，具體參數(shù)為I1=0.5 — 5.0毫米，r2=l.0 — 5.0毫米，n=l — 30，d=0.02 — 0.8毫米，α =0.1 — 30，以上！^為錐螺螺旋內(nèi)圈曲率半徑，r 2為錐螺螺旋外圈曲率半徑，d為鎳鈦合金絲的直徑，η為螺旋圈數(shù)，α為螺旋升角。鎳鈦電極從上部插入反應(yīng)孔。鎳鈦電極完全插入反應(yīng)孔時，頂