);參見圖 8)或標(biāo)準(zhǔn)染料（SAHA-TAMRA(PBI-4967);參見圖 8)被用于 使用NanoLuc-HDAC融合蛋白（SEQIDN0:3)的細(xì)胞內(nèi)BRET測(cè)定中。
[0089] 使用化Gene皿(Promega仿巧.）用編碼NanoLuc-HDAC6融合蛋白的質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn) 染肥K293細(xì)胞。用無啟動(dòng)子載體DNA(pGEM3幻W1:1000稀釋化noLuc-皿AC6DNAW在 96孔平板規(guī)格中產(chǎn)生Wng/孔的總DNA最終濃度（在20, 000個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度下）。 轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，接著在摩爾過量的未標(biāo)記的SAHA(作為特異性對(duì)照）存在或不存在 下將細(xì)胞與連續(xù)稀釋的示蹤劑一起解育。在用藥物示蹤劑平衡之后，W20uM的濃度添加 化rimazine(NanoLuc的腔腸素衍生物底物；PromegaCo巧），且在Varioskan光度計(jì)上量化 BRET。特異性BRET信號(hào)是通過將由SAHA示蹤劑單獨(dú)產(chǎn)生的信號(hào)減去非特異性信號(hào)（在未 標(biāo)記的SAHA存在下）來計(jì)算。
[0090] 圖 2 中的結(jié)果顯示SAHA-T0M(PBI-4968)綴合物 / 示蹤劑與SAHA-TMR(PBI-4967) 相比產(chǎn)生優(yōu)良的特異性BRET信號(hào)并且還產(chǎn)生針對(duì)在活細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的左移的ECs。值。作為 用于BRET應(yīng)用的藥物綴合物，可將PBI-4968T0M染料高于其它常用的巧光團(tuán)的益處用于使 用NANOLUC融合蛋白文庫的競(jìng)爭性結(jié)合測(cè)定或祀標(biāo)識(shí)鑒定（化學(xué)蛋白質(zhì)組）篩選。
[0091] 雖然此實(shí)施例證明藥物示蹤劑與已知的高親和力祀標(biāo)的結(jié)合，但在其它實(shí)施方案 中該類示蹤劑與NANOLUC融合蛋白文庫組合W概述（profile)祀標(biāo)家族中的相對(duì)藥物親和 力和特異性。在該種實(shí)施方案中，概況分析工作有助于鑒定具有混雜的結(jié)合概況的藥物，該 可能與不良的體內(nèi)藥物副作用有關(guān)聯(lián)。
[0092] 實(shí)施例2
[0093] 在本發(fā)明實(shí)施方案的開展期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)W顯示NanoLuc的低表達(dá)水平對(duì)于BRET 應(yīng)用的意外益處。
[0094] A)將肥K293細(xì)胞使用具有變化量的NanoLuc-HDAC6DNA的化gene皿來轉(zhuǎn)染并接 種于96孔平板規(guī)格中。對(duì)于轉(zhuǎn)染，用無啟動(dòng)子載體DNA(pGEM3幻稀釋NanoLuc-HDAC6DNA。 最終DM濃度/孔維持在50ng/孔；然而，W1:1〇、1:1〇〇和1:1000稀釋NanoLuc-HDAC6 DM(在96孔格式中W20, 000個(gè)細(xì)胞/孔的接種密度）。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，在固定濃度 (luM)的SAHA-T0M(PBI-4968 ;參見圖8)綴合物存在下用連續(xù)稀釋的SAHA處理細(xì)胞。解育 兩小時(shí)之后，添加化rimazine至20uM，且在Varioskan光度計(jì)上檢測(cè)BRET。圖3中的結(jié)果 顯示需要編碼NanoLuc融合體的DNA的出乎意料高的稀釋來實(shí)現(xiàn)對(duì)于BRET應(yīng)用適當(dāng)?shù)男?號(hào)本底比。
[0095] B)使用范圍在未稀釋至1:10,000(用無啟動(dòng)子載體DNA(如上所述的PGEM3Z) 稀釋W(xué)維持如上所述的恒定量的DM/轉(zhuǎn)染）內(nèi)的變化量的DNA將編碼NanoLuc-組胺 HUGPCR)融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)染到肥K293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，將細(xì)胞用美化拉 敏-bodip廠633(CellAura)進(jìn)行連續(xù)稀釋處理并平衡2小時(shí)。然后用化rimazine處理細(xì) 胞至20uM的濃度，且在Varioskan光度計(jì)上檢測(cè)BRET。
[0096] 圖3B中的結(jié)果表明需要編碼NanoLuc融合體的DM的大量稀釋來產(chǎn)生具有最 佳信號(hào)本底比的高親和力相互作用。稀釋NanoLuc融合蛋白至極低水平的能力在包括 NanoLuc融合蛋白的競(jìng)爭性結(jié)合測(cè)定或祀標(biāo)鑒定（化學(xué)蛋白質(zhì)組）篩選的各種BRET應(yīng)用中 是有益的。
[0097] 實(shí)施例3
[009引在本發(fā)明實(shí)施方案的開展期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)W顯示與傳統(tǒng)的生化（基于活性的）形式 相比用于量化前藥結(jié)合的細(xì)胞內(nèi)BRET測(cè)量的預(yù)測(cè)值。該個(gè)實(shí)施例包括天然前藥FK228,其 需要細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境W變得活化且能夠結(jié)合至HDAC6。
[0099] 將肥K293細(xì)胞用W如先前所述的載體DNA進(jìn)行1:1000稀釋的編碼 NanoLuc-HDAC6的DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，在固定濃度（luM)的SAHA-T0M(PBI-4968) 綴合物存在下將細(xì)胞與連續(xù)稀釋的天然前藥FK-228 -起解育。為了比較，并行進(jìn)行生化 的、基于活性的HDAC6測(cè)定。簡言之，在96孔平板的各孔中在100%DMS0中在100X下進(jìn) 行FK-228(Selleckchem目錄號(hào)S3020)的3倍連續(xù)稀釋。將此100X/100%DMS0滴定系列 的5yL等分試樣添加至245yL單獨(dú)的HDAC-Glo?I/II測(cè)定緩沖液（PromegaCo巧.）或 245yL補(bǔ)充有2X(0. 5mM)DTT的HDAC-Glo?I/II測(cè)定緩沖液中W便在96孔平板的各孔中 制備FK-228的2X/2%DMS0主要中間滴定系列。將5yL復(fù)制物從此主要中間滴定系列轉(zhuǎn) 移到白色384孔測(cè)定平板（Corning3673)的孔中。將2X(2nM)HDAC6炬PSBioscience目 錄號(hào)50006)的5yL添加物添加到所有孔中至InMHDAC6/孔的最終濃度。將10yL酶/ 抑制劑混合物在室溫下預(yù)解育45分鐘。將相等體積（lOuL)的HDAC-Glo?I/II最終檢 測(cè)試劑（PromegaCo巧.）添加至所有孔中（20yL最終測(cè)定體積），且在室溫下解育10分 鐘之后測(cè)量發(fā)光。對(duì)于所有測(cè)試條件，皿AC-Glo?I/II底物的最終濃度是50yM。使用來 自GraphPad的Prism?軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖（S形劑量響應(yīng)-可變斜率）（無DTT;實(shí)屯、圓； 0. 25mMDTT;空屯、方塊）。
[0100] 圖4A和4B中的結(jié)果表明需要細(xì)胞環(huán)境用于測(cè)量必須由細(xì)胞進(jìn)行加工W變得活化 的前藥的結(jié)合。
[0101] 實(shí)施例4
[0102] 在本發(fā)明實(shí)施方案的開展期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)W顯示使用滲透劑將不可滲透的藥物示 蹤劑引入細(xì)胞中。
[0103] 將肥K293細(xì)胞在用如先前所述的無啟動(dòng)子載體DNA1:1000稀釋DNA下，用編碼 PKCa(PKCa)-NanoLuc或NanoLuc-PKCa的DNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，用或不用毛地 黃皂巧處理細(xì)胞至50ug/血的最終濃度。然后用連續(xù)稀釋的星形抱菌素-PBI-染料綴合物 (PBI-5129 ;參見圖8)處理細(xì)胞。將細(xì)胞在加M作為用于結(jié)合的特異性對(duì)照的非綴合的星 形抱菌素存在或不存在下共解育。用示蹤劑平衡兩小時(shí)之后，添加化rimazine至20uM的 最終濃度并且在Varioskan光度計(jì)上測(cè)量BRET比率（圖5A和5B)。
[0104] 在第二實(shí)驗(yàn)中，將相同轉(zhuǎn)染的PK化-NanoLuc細(xì)胞用連續(xù)稀釋的毛地黃皂巧處理， 之后在加M未標(biāo)記的星形抱菌素（特異性對(duì)照）存在或不存在下用固定濃度的星形抱菌 素-T0M(PBI-5129 ;參見圖8)示蹤劑巧uM最終濃度）處理（圖5C)。
[01化]圖5A-C證明使用滲透劑加強(qiáng)不可滲透的藥物示蹤劑的進(jìn)入的能力且將此能力應(yīng) 用于NanoLuc?融合蛋白文庫的基于BRET的化學(xué)蛋白質(zhì)組篩選。
[0106] 實(shí)施例5
[0107] 在本發(fā)明實(shí)施方案的開展期間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)W顯示使用NanoLuc/BRET來測(cè)量活細(xì)胞 中的相對(duì)藥物親和力。在一些實(shí)施方案中，類似的實(shí)驗(yàn)被配置來從高通量化學(xué)篩選中優(yōu)化 先導(dǎo)物。
[0108] 用編碼NanoLuc-p38融合蛋白的DNA轉(zhuǎn)染肥K293細(xì)胞（在96孔規(guī)格中至50ng/ 孔的最終濃度）。轉(zhuǎn)染后二十四小時(shí)，在0. 5uMPBI-4838存在下用連續(xù)稀釋的BIRB-796或PBI-4835處理細(xì)胞炬IRB綴合衍生物；參見，例如美國13/682,589 引用的方式整體并 入本文）。
[0109]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定系統(tǒng)，其包含： (a) 拴系至熒光團(tuán)的生物活性劑； (b) 融合至生物發(fā)光報(bào)道子的細(xì)胞靶標(biāo)；以及 (c) 所述生物發(fā)光報(bào)道子的底物。
2. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述生物活性劑是小分子。
3. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述熒光團(tuán)是羧基若丹明類似物。
4. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述生物發(fā)光報(bào)道子包含與SEQ ID NO. :1具有至少 70%序列同一性的多肽。
5. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中（a)和（b)是在細(xì)胞內(nèi)。
6. 如權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其中（b)是作為融合體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。
7. 如權(quán)利要求5所述的系統(tǒng)，其中（a)是在細(xì)胞外添加并進(jìn)入所述細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述細(xì)胞靶標(biāo)是所述生物活性劑的結(jié)合配偶體。
9. 如權(quán)利要求8所述的系統(tǒng)，其中所述生物發(fā)光報(bào)道子的發(fā)射光譜與所述熒光團(tuán)的吸 收光譜重疊。
10. 如權(quán)利要求9所述的系統(tǒng)，其中所述生物活性劑一旦與所述細(xì)胞靶標(biāo)結(jié)合，所述底 物通過所述生物發(fā)光報(bào)道子向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化便造成所述熒光團(tuán)被BRET激發(fā)和來自所述 熒光團(tuán)的熒光發(fā)射。
11. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中（a)是拴系至熒光團(tuán)的生物活性劑的文庫中的一 個(gè)。
12. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中（b)是融合至生物發(fā)光報(bào)道子的多個(gè)細(xì)胞靶標(biāo)中的 一個(gè)。
13. 如權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其中所述生物活性劑或拴系至熒光團(tuán)的所述生物活性 劑是通過非天然化學(xué)合成產(chǎn)生的。
14. 一種檢測(cè)生物活性劑與細(xì)胞靶標(biāo)結(jié)合的方法，其包括如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所 述的系統(tǒng)。
15. -種細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的系統(tǒng)。
16. -種用于檢測(cè)生物活性劑與細(xì)胞靶標(biāo)之間的相互作用的方法，其包括： (a) 在細(xì)胞中表達(dá)所述細(xì)胞靶標(biāo)與在第一波長下發(fā)射能量的生物發(fā)光報(bào)道子的融合 體； (b) 將所述細(xì)胞與拴系至熒光團(tuán)的所述生物活性劑接觸，其中所述熒光團(tuán)在所述第一 波長下接收能量且在第二波長下發(fā)射能量； (c) 使所述細(xì)胞與所述生物發(fā)光報(bào)道子的底物接觸； (d) 在所述第二波長下檢測(cè)能量，其中在所述第二波長下所述能量的存在指示所述生 物活性劑與所述細(xì)胞靶標(biāo)相互作用。
【專利摘要】本發(fā)明提供用于檢測(cè)和分析生物活性劑與細(xì)胞靶標(biāo)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的組合物和方法。具體地說，本文提供拴系至熒光團(tuán)的生物活性劑；融合至生物發(fā)光報(bào)道子、或生物發(fā)光報(bào)道子的部分、組分或亞基的細(xì)胞靶標(biāo)；以及檢測(cè)和分析生物活性劑與隨其的細(xì)胞靶標(biāo)的相互作用的方法。
【IPC分類】C40B40-04, C07D491-22, C40B40-10, C12Q1-66, C12N15-62, G01N33-52, C12N5-10, C07D491-147, C12N9-02
【公開號(hào)】CN104871001
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201380064252
【發(fā)明人】C·W·希特科, T·柯克蘭, T·馬赫萊特, R·F·奧哈納, M·羅貝斯, K·伍德
【申請(qǐng)人】普洛麥格公司
【公開日】2015年8月26日
【申請(qǐng)日】2013年12月12日
【公告號(hào)】CA2894435A1, US20140194307, WO2014093677A1