使用細(xì)胞內(nèi)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移識(shí)別生物活性劑的細(xì)胞靶標(biāo)結(jié)合的制作方法
【專利說明】使用細(xì)胞內(nèi)生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移識(shí)別生物活性劑的細(xì)胞 朝標(biāo)結(jié)合
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年12月12日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No. 61/736,429 ; 2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No. 61/794, 461 及2013年9月19日提 交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)序列No. 61/880, 048的優(yōu)先權(quán)，每個(gè)專利在此W引用的方式整體并 入。
[000引領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明提供用于檢測(cè)和分析生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合的組合物和方 法。具體說來，本文提供拴系至巧光團(tuán)的生物活性劑；融合至生物發(fā)光報(bào)道子、或生物發(fā)光 報(bào)道子的部分、組分或亞基的細(xì)胞祀標(biāo)；W及檢測(cè)和分析生物活性劑與隨其的細(xì)胞祀標(biāo)的 相互作用的方法。
[000引背景
[0006] 分子種類與細(xì)胞祀標(biāo)的相互作用在理解細(xì)胞生理學(xué)和開發(fā)治療干預(yù)措施如新的 合成藥物和生物藥劑中是極其重要的。需要精確且高效地測(cè)定祀標(biāo)結(jié)合（engagement)的 方法，特別是在其中該些相互作用介導(dǎo)其表型響應(yīng)的活細(xì)胞內(nèi)。有效地檢測(cè)祀標(biāo)結(jié)合的能 力對(duì)發(fā)現(xiàn)過程具有廣泛的啟示，包括高通量篩選、優(yōu)化對(duì)藥物先導(dǎo)物的命中物化it)的篩 選、W及發(fā)現(xiàn)和表征治療相關(guān)的細(xì)胞祀標(biāo)。
[0007] 使用小分子文庫(kù)的基于表型的篩選在藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域中起重要作用。使用該種篩 選方法，在沒有預(yù)先得知其潛在的細(xì)胞祀標(biāo)的情況下就其引發(fā)表型響應(yīng)（例如緩解疾病癥 狀）的能力對(duì)化合物文庫(kù)進(jìn)行篩選。雖然此方法可用于鑒定能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生理的生物活性 劑，例如小分子，但確定該些小分子命中物的生物相關(guān)祀標(biāo)是主要的技術(shù)挑戰(zhàn)。另外，促進(jìn) 一些想要的表型響應(yīng)的小分子可由于脫祀相互作用而成為體內(nèi)不利因素。為了預(yù)測(cè)藥物選 擇性并使可能的副作用減至最少，重要的是還鑒定了脫祀相互作用（例如較低的親和力）。 目前用于鑒定生物活性劑祀標(biāo)的大多數(shù)方法都依賴使用含有選擇性部分（例如生物活性 劑或相關(guān)化合物）和分類部分（例如親和標(biāo)記物或固體支持物）的"雙官能"化合物從復(fù)雜 的細(xì)胞裂解物富集該些祀標(biāo)。因?yàn)楦患腔诨衔锏慕Y(jié)合特性，其中該些化合物對(duì)于其 祀標(biāo)的固有親和力是不夠的，所W化合物類似物被設(shè)計(jì)W便共價(jià)地結(jié)合至祀標(biāo)（例如光交 聯(lián)）。通過任一種方法，祀標(biāo)分離的效力和特異性是必需的，且該些方法的失敗率很高。該 些方法的失敗可能是由于祀標(biāo)的不充分捕獲或因非特異性捕獲所致的高本底。此失敗的影 響因素包括；化合物W低至中等親和力在難W檢測(cè)的該些相對(duì)較弱的相互作用下結(jié)合多個(gè) 祀標(biāo)；缺乏穩(wěn)固的、簡(jiǎn)明的、無(wú)偏技術(shù)來表征檢測(cè)到的相互作用；不能在相互作用可依賴的 天然細(xì)胞環(huán)境內(nèi)進(jìn)行祀標(biāo)分離；所提供的關(guān)于祀標(biāo)在細(xì)胞中的結(jié)合效能的信息有限；W及 由于非特異性結(jié)合至固體支持物或官能化小分子所致的假陽(yáng)性相互作用的高本底。
[000引 概述
[0009] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供BRET測(cè)定系統(tǒng)，其包含；(a)拴系至發(fā)色團(tuán)（例如 巧光團(tuán)）的生物活性劑；化）融合至生物發(fā)光報(bào)道子的細(xì)胞祀標(biāo)；W及（C)所述生物發(fā)光報(bào) 道子的底物。在一些實(shí)施方案中，生物活性劑是小分子。在一些實(shí)施方案中，生物活性劑是 蛋白質(zhì)功能的抑制劑，例如酶抑制劑或受體抑制劑。在一些實(shí)施方案中，發(fā)色團(tuán)是巧光團(tuán)。 在一些實(shí)施方案中，巧光團(tuán)是駿基若丹明類似物。在一些實(shí)施方案中，生物發(fā)光報(bào)道子包含 與SEQIDN0:1具有至少70%序列同一性（例如，75%同一性…80%同一性…85%同一 性…90%同一性、95%同一性…98%同一性…99%同一性）的多膚。在一些實(shí)施方案中， 化）是融合至生物發(fā)光報(bào)道子的部分、或亞基或組分的細(xì)胞祀標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，化） 是融合至需要與另一多膚相互作用W產(chǎn)生發(fā)光的多膚的細(xì)胞祀標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，（a) 和化）是在細(xì)胞內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，（b)作為與目標(biāo)蛋白質(zhì)（例如細(xì)胞祀標(biāo)）一起的 融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞祀標(biāo)由一種W上組分、亞基或多膚組成， 例如，細(xì)胞祀標(biāo)是蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，生物發(fā)光報(bào)道子由一種W上組分、亞 基或多膚組成，例如，生物發(fā)光報(bào)道子是蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，（a)是在細(xì)胞 外添加的并進(jìn)入細(xì)胞中。在一些實(shí)施方案中，（a)存在于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞周圍的介質(zhì)中。在 一些實(shí)施方案中，（a)結(jié)合至細(xì)胞和于細(xì)胞周圍的介質(zhì)中存在。在一些實(shí)施方案中，（a)存 在于周圍介質(zhì)中的量顯著地大于在細(xì)胞中或結(jié)合至細(xì)胞的量，例如大至少2倍、至少5倍、 10倍、30倍或100倍。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞祀標(biāo)是生物活性劑的結(jié)合配偶體。在一些 實(shí)施方案中，生物發(fā)光報(bào)道子的發(fā)射光譜與巧光團(tuán)的吸收光譜重疊。在一些實(shí)施方案中，生 物活性劑一旦與細(xì)胞祀標(biāo)結(jié)合，底物通過生物發(fā)光報(bào)道子向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化便造成巧光團(tuán) 由BRET激發(fā)和來自巧光團(tuán)的光發(fā)射。在一些實(shí)施方案中，（a)是拴系至發(fā)色團(tuán)的試劑或化 合物文庫(kù)中的一個(gè)。在一些實(shí)施方案中，（a)是拴系至巧光團(tuán)的試劑或化合物文庫(kù)中的一 個(gè)。在一些實(shí)施方案中，化）是融合至生物發(fā)光報(bào)道子的多個(gè)潛在的細(xì)胞祀標(biāo)中的一個(gè)。在 一些實(shí)施方案中，化）是表達(dá)融合至生物發(fā)光報(bào)道子的多個(gè)潛在的細(xì)胞祀標(biāo)中的一個(gè)的細(xì) 胞的文庫(kù)。
[0010] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)、分析、 表征等的方法。在一些實(shí)施方案中，細(xì)胞祀標(biāo)可W是主要的藥物祀標(biāo)。在一些實(shí)施方案中， 細(xì)胞祀標(biāo)是可在體內(nèi)引起不希望的副作用的脫祀傾向（liability)。在一些實(shí)施方案中，生 物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的結(jié)合可能不具有可辨別的生物效應(yīng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提 供細(xì)胞，其包含W下一個(gè)或多個(gè)（例如其中的每一個(gè)）；(a)拴系至發(fā)色團(tuán)（例如巧光團(tuán)） 的生物活性劑；化）融合至生物發(fā)光報(bào)道子的細(xì)胞祀標(biāo)；W及（C)所述生物發(fā)光報(bào)道子的底 物。在一些實(shí)施方案中，生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的結(jié)合是非共價(jià)的。在一些實(shí)施方案中，發(fā) 色團(tuán)是巧光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)之間的相 互作用的方法，其包括；(a)在細(xì)胞中表達(dá)所述細(xì)胞祀標(biāo)與在第一波長(zhǎng)（例如，波長(zhǎng)范圍、光 譜分布等）下發(fā)射能量的生物發(fā)光報(bào)道子的融合體；化）使所述細(xì)胞與拴系至巧光團(tuán)的所 述生物活性劑接觸，其中所述巧光團(tuán)在所述第一波長(zhǎng)下接收能量且在第二波長(zhǎng)（例如，波 長(zhǎng)范圍、光譜分布等）下發(fā)射能量；（C)使所述細(xì)胞與所述生物發(fā)光報(bào)道子的底物接觸；（d) 在所述第二波長(zhǎng)下檢測(cè)能量，其中在所述第二波長(zhǎng)下所述能量的存在指示所述生物活性劑 與所述細(xì)胞祀標(biāo)相互作用。
[0011] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)之間的相互作用 的方法，其包括；(a)提供所述細(xì)胞祀標(biāo)與生物發(fā)光報(bào)道子的融合體；化）使所述融合體與 拴系至發(fā)色團(tuán)（例如巧光團(tuán)）的所述生物活性劑接觸；（C)使所述融合體與所述報(bào)道子的 底物接觸；（d)檢測(cè)發(fā)射光的光譜分布在不存在所述發(fā)色團(tuán)下相對(duì)于與所述底物接觸的所 述融合體的變化。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于檢測(cè)第二生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的 相互作用的方法，其包括；(a)提供所述細(xì)胞祀標(biāo)與生物發(fā)光報(bào)道子的融合體；化）使所述 融合體與拴系至發(fā)色團(tuán)（例如巧光團(tuán)）的第一生物活性劑和所述第二生物活性劑接觸；（C) 使所述融合體與所述報(bào)道子的底物接觸；（d)檢測(cè)發(fā)射光的光譜分布在不存在所述第二生 物活性劑下相對(duì)于與所述第一生物活性劑和所述底物接觸的所述融合體的變化。在一些實(shí) 施方案中，發(fā)射光的光譜分布的變化是由于所述第二生物活性劑置換所述第一生物活性劑 而引起。在一些實(shí)施方案中，所述置換是競(jìng)爭(zhēng)性置換。在一些實(shí)施方案中，發(fā)射光的光譜分 布的變化被用于估計(jì)生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，所述第二 生物活性劑是多種生物活性劑中的一種。在一些實(shí)施方案中，發(fā)射光的光譜分布的變化被 用于估計(jì)多種生物活性劑與細(xì)胞祀標(biāo)的相對(duì)結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方案中，所述第一生 物活性劑和所述第二生物活性劑是合成分子。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞祀標(biāo)是在活細(xì) 胞、透化的細(xì)胞或細(xì)胞裂解物中。在一些實(shí)施方案中，發(fā)射光的光譜分布的變化是通過測(cè)量 在兩個(gè)不同波長(zhǎng)或兩個(gè)不同波長(zhǎng)范圍下的光強(qiáng)度的比率來測(cè)定的。在一些實(shí)施方案中，檢 測(cè)光譜分布隨時(shí)間的變化。在一些實(shí)施方案中，發(fā)色團(tuán)是巧光團(tuán)。
[0012] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種BRET測(cè)定系統(tǒng)，其包含；(a)拴系至巧光團(tuán)的 生物活性劑；化）融合至生物發(fā)光報(bào)道子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)膚的第一相互作用配偶體；（C)融合至 生物發(fā)光報(bào)道子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)多膚的第二相互作用配偶體；W及（d)所述生物發(fā)光報(bào)道子的 底物，其中第一與第二相互作用配偶體相互作用W形成相互作用復(fù)合物，并且其中第一相 互作用配偶體、第二相互作用配偶體和/或相互作用復(fù)合物是所述生物活性劑的結(jié)合配偶 體。在一些實(shí)施方案中，第一相互作用配偶體和第二相互作用配偶體是相互作用W形成蛋 白質(zhì)復(fù)合物的蛋白質(zhì)或多膚。在一些實(shí)施方案中，第一相互作用配偶體和第二相互作用配 偶體通過結(jié)構(gòu)互補(bǔ)多膚的相互作用被合在一起。在一些實(shí)施方案中，結(jié)構(gòu)互補(bǔ)多膚通過第 一相互作用配偶體與第二相互作用配偶體的相互作用被合在一起。在一些實(shí)施方案中，第 一相互作用配偶體與第二相互作用配偶體的相互作用是通過發(fā)光的增加來測(cè)定的。在一些 實(shí)施方案中，第一與第二相互作用配偶體在生物活性劑的存在或不存在下形成相互作用復(fù) 合物。在一些實(shí)施方案中，相互作用復(fù)合物是生物活性劑的結(jié)合配偶體，但第一或第二相互 作用配偶體單獨(dú)都不是生物活性劑的結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，相互作用配偶體中 的一個(gè)而非另一個(gè)是生物活性劑的結(jié)合配偶體。在一些實(shí)施方案中，相互作用復(fù)合物形成 需要生物活性劑結(jié)合至相互作用配偶體。在一些實(shí)施方案中，相互作用復(fù)合物形成不依賴 于生物活性劑的結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供BRET測(cè)定系統(tǒng)，其包含；(a)拴系至 巧光團(tuán)的生物活性劑；化）融合至生物發(fā)光報(bào)道子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)膚的細(xì)胞祀標(biāo)；（C)生物發(fā)光 報(bào)道子的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)多膚；W及（d)生物發(fā)光報(bào)道子的底物。在一些實(shí)施方案中，生物發(fā)光報(bào) 道子的互補(bǔ)膚和多膚締合形成活性生物發(fā)光報(bào)道酶。在一些實(shí)施方案中，一旦生物活性劑 與細(xì)胞祀標(biāo)結(jié)合且互補(bǔ)膚和多膚締合，底物通過生物發(fā)光報(bào)道酶向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化便造成 巧光團(tuán)被BRET激發(fā)和來自所述巧光團(tuán)的巧光發(fā)射。
[0013] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種測(cè)定系統(tǒng)，其包含；(a)拴系至巧光團(tuán)的生物 活性劑；化）融合至生物發(fā)光報(bào)道子的互補(bǔ)膚的第一結(jié)合配偶體；（C)融合至生物發(fā)光報(bào)道 子的互補(bǔ)多膚的第二結(jié)合配偶體；W及（C)生物發(fā)光報(bào)道子的底物。在一些實(shí)施方案中，生 物發(fā)光報(bào)道子的互補(bǔ)膚和多膚締合形成活性生物發(fā)光報(bào)道酶。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝?與第二結(jié)合配偶體相互作用，生物活性劑結(jié)合至相互作用配偶體且互補(bǔ)膚和多膚發(fā)生締合 時(shí)，底物通過生物發(fā)光報(bào)道酶向反應(yīng)產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化造成巧光團(tuán)被BRET激發(fā)和來自所述巧光 團(tuán)的巧光發(fā)射。
[0014] 在一些實(shí)施方案中，生物活性劑拴系至巧光或發(fā)光巧滅劑（例如D油cyl)。在該樣 的實(shí)施方案中，未拴系的生物活性劑的滴定產(chǎn)生信號(hào)增益。
[0015] 在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)本文所述的任一系統(tǒng)成像（例如，BRET成像、經(jīng) 由電荷禪合器件攝影機(jī)等）W便證實(shí)和/或鑒定巧光的位置（例如胞內(nèi)、胞外等）和/或 由系統(tǒng)組分（例如生物活性劑、細(xì)胞祀標(biāo)等）的存在和/或相互作用產(chǎn)生的BRET信號(hào)。
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