一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法及其指紋圖譜，屬于中藥分析領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]冠心丹參膠囊由丹參、三七、降香油組成，具有活血化瘀、理氣止痛等功效，臨床主要用于治療氣滯血瘀所致的胸痹心痛。冠心丹參膠囊用于氣滯血瘀型冠心病所致的胸悶、胸痛、心悸氣短。對垂體后葉素引起的大鼠心電圖缺血性改變有一定的作用，可降低血清磷酸肌酸和乳酸脫氫酶，減少心肌組織中丙二醛的生成，保護心肌組織超氧化物歧化酶的活性，增強注射異丙腎上腺素小鼠耐缺氧的能力。中國藥典(2010年版)以丹參酮II A為檢測指標，對該藥進行定量控制。然而，丹參中水溶性物質(zhì)對心腦血管疾病也具有良好的效果，如丹參素能明顯擴張冠狀動脈使其血流量顯著增加；原兒茶醛具有擴張動脈、降低心肌耗氧量、抑制血小板聚集等作用，酚酸成分具有很強的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基等作用。因此，丹參水溶性物質(zhì)含量的高低也將影響冠心丹參膠囊的療效，以上多種成分同時定量控制能更好地表征冠心丹參膠囊的質(zhì)量。
[0003]近年來，關(guān)于冠心丹參制劑質(zhì)量控制方法的報道較多，主要有薄層色譜鑒別、分光光度法、液相色譜-紫外分光光度法(HPLC-UV)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)法等。魏惠珍等在《HPLC同時測定冠心丹參膠囊中丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B和丹參酮A的含量》一文中建立了一種同時測定丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B、丹參酮II A4種指標成分的含量測定方法，可用于冠心丹參膠囊的質(zhì)量控制和治療藥物監(jiān)測。黃喜茹等在《冠心丹參制劑的質(zhì)量控制方法研宄》中建立反相高效液相色譜法同時測定冠心丹參制劑中3種丹參脂溶性成分隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量。劉亞東等在《HPLC法測定冠心丹參膠囊中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮II A含量》建立了高效液相色譜法同時測定冠心丹參膠囊中隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮II A含量的方法，方法簡便快捷、準確、重現(xiàn)性好，可用于該制劑的質(zhì)量控制。雖然目前對其質(zhì)量標準與藥理臨床研宄較多，但其廣泛而顯著的藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)還有待進一步深入研宄，其質(zhì)量控制方法也需要更精細更全面的更全面的控制方法研宄。
[0004]中藥指紋圖譜是指通過現(xiàn)代的分析檢測方法對中藥復(fù)雜的物質(zhì)體系進行分析，并盡可能全面地獲得中藥中多個化學成分的化學特征圖譜，并通過特征峰的有無及各峰之間的強度比來對中藥中化學成分進行定性和定量分析，用于中藥的質(zhì)量控制和新藥研發(fā)的物質(zhì)基礎(chǔ)的信息表征手段和方法；中藥指紋圖譜是建立在對中藥中化學成分進行系統(tǒng)全面研宄的基礎(chǔ)上的一種多方面的，可量化的鑒定手段，具有宏觀、整體評價和模糊分析等特點，特別適合于中藥復(fù)雜體系的整體研宄。中藥指紋圖譜是目前已經(jīng)成為一種能被國內(nèi)外學者廣泛接受的質(zhì)量控制模式，日本、美國FDA、世界衛(wèi)生組織等都允許使用指紋圖譜作為單味藥材提取物的質(zhì)量評價方法，而在國內(nèi)中藥的指紋圖譜也成為中藥質(zhì)量評價的研宄熱點。HPLC指紋圖譜具有分離效果好、檢測靈敏度高、分析速度快、結(jié)果重現(xiàn)性好等優(yōu)點，是中藥指紋圖譜研宄應(yīng)用較多的方法之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有冠心丹參膠囊質(zhì)量控制方法的不足，提供一種HPLC指紋圖譜的建立方法及用該方法所得的HPLC標準指紋圖譜。其特點是將冠心丹參膠囊制備成供試品溶液，經(jīng)過HPLC分離檢測，獲得冠心丹參膠囊HPLC標準指紋圖譜。本研宄采用高效液相色譜法對冠心丹參膠囊指紋圖譜進行了研宄，并應(yīng)用“中藥指紋圖譜相似度評價軟件”對不同批號的冠心丹參膠囊指紋圖譜相似度進行評價，結(jié)果顯示，采用本發(fā)明方法所建立的冠心丹參膠囊指紋圖譜具有分離效果好，檢測靈敏度高，結(jié)果重現(xiàn)性好的優(yōu)點，可為冠心丹參膠囊的真?zhèn)舞b別和內(nèi)在質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。
[0006]一種冠心丹參膠囊指紋圖譜的建立方法，其特征是采用HPLC-UV法，包括如下步驟:
[0007](I)供試品溶液的制備:精密稱取冠心丹參膠囊內(nèi)容物I?20g，加70%甲醇25?500ml，超聲20?40min溶解后，冷卻后取少量上清液過0.45 μ m微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0008](2)對照品溶液的制備:精密稱取丹參素鈉、迷迭香酸、丹酚酸B、原兒茶醛、二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮1、丹參酮IIA適量，分別用50%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇、甲醇溶解成濃度分別為200 μ g/ml的溶液，再吸取對照品溶液各適量，用甲醇稀釋成濃度分別為50 μ g/ml的對照品溶液；
[0009](3)色譜條件:十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱，250X4.6mm ;流動相為0.1%磷酸水溶液_乙腈；采用梯度洗脫方式Omin — 40min — 42min — 60min — 65min — 95min，甲醇 10% — 40% — 60% — 70% — 95%— 95%;流速 0.8ml/min ;柱溫 25 ?35°C;檢測波長:270nm ;進樣量為10?20 μ I ;
[0010](4)供試品溶液的測定:精密吸取供試品溶液注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，得到冠心丹參膠囊的HPLC-UV圖譜；
[0011](5)HPLC標準指紋圖譜的制作按照上述方法對10批供試品溶液和對照品溶液，注入液相色譜儀，以高效液相色譜法測定，記錄色譜圖，得到10批冠心丹參膠囊的圖譜；并進行分析比較，得到由測定所得的指紋圖譜中有11個共有峰，這些共有特征峰構(gòu)成了冠心丹參膠囊的指紋特征，圖譜經(jīng)《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》軟件計算，相似度大于
0.9 ;是冠心丹參膠囊標準指紋圖譜，所述的冠心丹參膠囊標準指紋圖譜如附圖1所示。
[0012]其中，以5號峰即丹酚酸B為參照物峰，各峰的相對保留時間為:峰I丹參素鈉:相對保留時間0.206 ;峰2原兒茶醛:相對保留時間0.370 ;峰3迷迭香酸:相對保留時間
0.894 ;峰4:相對保留時間0.924 ;峰5丹酚酸B:相對保留時間1.000 ;峰6:相對保留時間
1.070 ;峰7:相對保留時間1.716 ;峰8 二氫丹參酮:相對保留時間1.892 ;峰9隱丹參酮:相對保留時間2.101 ;峰10丹參酮1:相對保留時間2.148 ;峰11丹參酮IIA:相對保留時間 2.422。
[0013]優(yōu)選地，所述的冠心丹參膠囊標準指紋圖譜中，以5號峰即丹酚酸B為參照物峰，各峰的相對保留時間和相對峰面積分別為:
[0014]峰I丹參素鈉:相對保留時間0.206，相對峰面積0.104 ；
[0015]峰2原兒茶醛:相對保留時間0.370，相對峰面積0.097 ；
[0016]峰3迷迭香酸:相對保留時間0.894，相對峰面積0.090 ；
[0017]峰4:相對保留時間0.924，相對峰面積0.080 ；
[0018]峰5丹酚酸B:相對保留時間1.000，相對峰面積1.000 ；
[0019]峰6:相對保留時間1.070，相對峰面積0.179 ；
[0020]峰7:相對保留時間1.716，相對峰面積0.017 ；
[0021]峰8 二氫丹參酮:相對保留時間1.892，相對峰面積0.047 ；
[0022]峰9隱丹參酮:相對保留時間2.101，相對峰面積0.239 ；
[0023]峰10丹參酮1:相對保留時間2.148，相對峰面積0.145 ；
[0024]峰11丹參酮IIA:相對保留時間2.422，相對峰面積0.602 ；
[0025]實驗例I HPLC-UV紫外檢測波長的選擇
[0026]冠心丹參膠囊的組方有三七、丹參、降香三味藥材，各藥味的化學成分復(fù)雜，各成分的色譜行為及儀器的響應(yīng)值也是迥乎不同，因此應(yīng)在整體全面的原則下對測定波長進行選擇。取供試品溶液20 μ 1，注入液相色譜儀，采用二極管陣列檢測器篩選波長，對樣品進行190-400nm全波長掃描，結(jié)果見圖2樣品三維紫外吸收圖和圖3樣品的等高線圖。由樣品的三維紫外吸收圖和等高線圖可見，樣品中主要成分在200nm?360nm的紫外吸收較強，分別比較了 190nm、203nm、254nm、270nm、330nm、360nm的樣品紫外吸收光譜圖，結(jié)果270nm為檢測波長檢出的樣品信息量較多，其分離度、峰形和柱效及出峰的穩(wěn)定性較為滿意，故選擇270nm為檢測波長。
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