一種檢測土霉素的適體電極及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測用傳感器技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了在適配體上加入一段引物，引發(fā)RCA用RCA循環(huán)放大的方法制備的檢測土霉素的適體電極。同時，本發(fā)明還涉及對土霉素檢測的電化學(xué)適體電極的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]土霉素(OTC)是一種四環(huán)素類物質(zhì)，四環(huán)素類是由鏈霉菌產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上都屬于多環(huán)并四苯羧基酰胺母核的衍生物，可分為天然品和四環(huán)素類抗生素，一般通過與核蛋白體的30S亞單位結(jié)合，阻止氨?；鵷RNA同核蛋白體結(jié)合產(chǎn)生藥理作用，起到抑菌、殺菌作用。20世紀(jì)40年代末、50年代初，金霉素、土霉素和四環(huán)素相繼從鏈霉菌發(fā)酵液中分離得到，這3種四環(huán)素類抗生素都顯示了完全的交叉抗性，有著相似的、廣泛的抗菌譜，對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌、支原體、立克次體和衣原體之類的微生物都有活性。確立一個靈敏的高選擇性的方法臨床診斷和在食品安全分析中檢測四環(huán)素類是至關(guān)重要的。土霉素、金霉素、四環(huán)素的檢測方法主要有高效液相色譜法、免疫學(xué)方法、毛細(xì)管電泳法和微生物學(xué)方法。
滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是一種等溫信號擴(kuò)增方法，DNA可在很短時間內(nèi)實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。因此，可用于痕量分子的檢測。目前，該技術(shù)既可以擴(kuò)增環(huán)狀DNA、RNA，也可以擴(kuò)增線性DNA，甚至全基因組DNA。目前該技術(shù)主要用于全基因組擴(kuò)增、核酸測序、單核苷酸多態(tài)性以及DNA芯片、蛋白質(zhì)芯片分析等廣泛領(lǐng)域。
[0003]傳統(tǒng)的土霉素殘留分析方法大多是微生物法和儀器分析法，需要大型儀器，成本較高，或者檢測步驟繁瑣，難以滿足實時檢測的要求。因此，為應(yīng)對全球性抗生素污染的現(xiàn)狀，開發(fā)簡單、快速、準(zhǔn)確的土霉素檢測方法愈發(fā)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)中針對現(xiàn)有檢測方法中檢測成本高，儀器操作復(fù)雜，需要專業(yè)操作人員的缺點，本發(fā)明設(shè)計了基于核酸適配子的新型夾心構(gòu)型的用于土霉素檢測的電化學(xué)適體電極。
[0005]同時，本發(fā)明還提供了所述電化學(xué)適體電極的制備方法。
[0006]本發(fā)明提供的電化學(xué)適體電極，是通過以下步驟得到的:
O氧化石墨稀-金納米粒子復(fù)合物的制備；
氧化石墨烯(GO)的制備:
氧化石墨烯(GO)的制備是根據(jù)經(jīng)典的方法。簡而言之，1.0 g石墨粉加入到含有0.5g硝酸鈉(NaNO3)和3.0 g高錳酸鉀(KMnO4)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的50 mL濃硫酸(H2SO4)中。溫度低于20 °0下，反應(yīng)I h，升溫到35°C，繼續(xù)攪拌30 min。然后緩慢加入約100 mL的離子水，持續(xù)攪拌20 min后，加入50 mL H2O2 (30%)，來還原殘留的氧化劑，溶液漸漸變成亮黃色；趁熱過濾，用HCl溶液和去離子水洗滌直到濾液中無硫酸根被檢測到為止。沉淀物在60 °C的恒溫箱中干燥，最終得到GO。
[0007]合成石墨稀-金納米(rGO-Au)納米復(fù)合物:
玻碳電極首先在0.3和0.05 μ m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用二次水沖洗；20yL 1.0 mg mL—1氧化石墨烯滴加在已處理好的鏡面裸電極上，干燥；之后電極浸入10 mL含有2.8 mmoir1 HAuCldP 0.1H2SO4溶液，通過循環(huán)伏安一步電化學(xué)共還原，得到rGO-Au復(fù)合物。其中循環(huán)伏安參數(shù):電位設(shè)置為0.0到-1.5 V，掃描速率0.05 V/S。
[0008]所述還原石墨稀-金納米復(fù)合物中石墨稀與金的質(zhì)量比3.3:100 ；
所述氧化石墨稀-金納米粒子復(fù)合物層的厚度為100 nm±15nm ；
2)玻碳電極首先在0.3和0.05 y m的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水反復(fù)沖洗。后將電極浸入在10 UL已經(jīng)制備的氧化石墨烯-金納米粒子溶液中，保持3 ho待用二次水沖洗幾次之后，10 μ L買到的BSA-OTC耦合物(10 μ Μ)溶液滴加在電極表面，室溫下保持150 min，使BSA-OTC復(fù)合物完全固定在電極上。
[0009]所述BSA-OTC耦合物層的厚度為I μ m±0.2 μ m ;
3)室溫下，所得電極在PBS緩沖液中充分?jǐn)噭忧逑春螅譃閮山M，將第一組電極放入待檢測土霉素的PH=7.4的PBS緩沖液中孵育2 h ;第二組電極放入不含待檢測目標(biāo)物的PH=7.4的PBS緩沖液中孵育2 h ；
4)制備環(huán)狀探針:
本實驗共用到四段DNA序列:
引物(primer):5' -GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC-3, (SEQ ID NO:I)；
OTC 核酸適配體(aptamer):5' - GTT GGA AGT GGT AGT GGA GTC GGA ATT CGC TAGCAC GTT GAC GCT GGT GCC CGG TTG TGG TGC GAG TGT TGT GTG GAT CCG AGC TCC ACGTG-(CH2) 6-SH-3, (SEQ ID NO:2)；
掛鎖探針(padlock probe):5/ -phosphate-CTA CTA CCT CAC CTC AGC AAC TAT ACAACC TAC TAC CTC ACC TCA GCA ACT ATA CAA CCT ACT ACC TCA CCT CAG CAA CTA TACAAC-3' (SEQ ID NO:3);
連接探針(Ligat1n probe): 5' -UGA GGU AGU AGG UUG UAU AGU U_3' (SEQ IDNO:4)o
[0010]下劃線部分是堿基互補成環(huán)序列。
[0011]所述的制備方法，優(yōu)選環(huán)狀探針是通過以下步驟得到的:
(1)取3乩掛鎖探針9u L連接探針于已滅菌的100 μ L離心管內(nèi)，加入6 μ L T 4 DNA連接酶緩沖溶液，50 μ L滅菌水，震蕩均勻，生料帶封閉；
(2)將此離心管放入95°C恒溫lOmin，37°C恒溫2h，使之雜交完全；
(3)加入2yLT4DNA連接酶，封口膜封口，16°C恒溫2h，是掛鎖探針連接完全后，65°C恒溫20min使T4DNA連接酶變性；
(4)加入Iμ L核酸外切酶I在37°C保溫Ih將連接探針?biāo)夂?0°C恒溫20min使核酸外切酶I變性。
[0012]5)第一組電極中，10 UL濃度為IyM —端帶有OTC核酸適配體通過與游離目標(biāo)物OTC之間的強識別能力，與其結(jié)合，剩余的核酸適配體則與固定在電極表面的BSA-OTC耦合物結(jié)合，孵育2 h ;第二組電極中，相同的10 UL相同濃度為I μΜ的核酸適配體全部與電極表面的BSA-OTC耦合物結(jié)合，孵育2 h ；
6)用PBS沖洗，將游離的與適配體結(jié)合的目標(biāo)物OTC洗去；放入制備好的10 μ L環(huán)狀探針(30μΜ)，再放入 lyLdNTP，0.4yL 100*BSA, I μ L Phi29DNA 聚合酶，2 μ L Phi29DNA聚合酶buffer，在37°C下，孵育1.5 h，使環(huán)形探針在引物的引發(fā)作用下進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制放大(RCA)反應(yīng)。
[0013]7)加入10 μ L濃度為4 mM的亞甲基藍(lán)，它是一種電活性物質(zhì)，它能夠嵌入G四連體中，表示電信號的大小。與RCA擴(kuò)增出來的長鏈由于序列形成G四連體結(jié)構(gòu)，即得檢測土霉素的電化學(xué)適體電極。
[0014]首先制備一種用于檢測土霉素OTC的電化學(xué)適體電極，將金納米粒子修飾在氧化石墨烯表面，再將它修飾在玻碳電極上。再以牛血清白蛋白BSA為載體，與土霉素形成BSA-OTC耦合物。將耦合物修飾固定于電極上。
[0015]修飾好的電極分為兩組，一組加入待檢測目標(biāo)物土霉素，另一組不加土霉素作為對照。然后加入等量的末端修飾有引物的適配體，在第一組電極中，該適配體優(yōu)先與后加入的游離的目標(biāo)土霉素結(jié)合，剩余的適配體與修飾在電極表面的土霉素結(jié)合；在第二組電極中，由于沒有目標(biāo)物的存在，該適配體只與修飾在電極表面的土霉素結(jié)合。
[0016]用溶液洗滌加入適配體后的電極，去除游離的目標(biāo)土霉素OTC。然后加入合成好的環(huán)狀探針，在帶有適配體的引物的存在下，開始進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制擴(kuò)增反應(yīng)。
[0017]環(huán)狀探針得到的長鏈折疊成G四連體結(jié)構(gòu)，加入亞甲基藍(lán)后，可與G四連體結(jié)合，由于亞甲基藍(lán)的存在，通過電極檢測到電信號。亞甲基藍(lán)越多，電信號則越強。
[0018]所述的電化學(xué)適體電極，用于修飾的金納米粒子大小約為30 nm，優(yōu)選修飾有納米金的石墨烯的厚度為100 nm左右，BSA-OTC耦合物的厚度為I μπι左右，BSA的厚度為500nm左右。目標(biāo)物OTC的厚度約為500 nm。
[0019]所述的電化學(xué)適體電極的制備方法，優(yōu)選包括以下步驟:
(I)氧化石墨稀-金納米粒子復(fù)合物修飾玻碳電極修飾的傳感器制備方法。
[0020](2)將電極浸入BSA-OTC耦合物溶液中3 h，用二次水沖洗，干燥；
(3)將電極均勻分為兩組，在第一組電極表面滴加OTC目標(biāo)物溶液，室溫下過夜；第二組不加0TC，與第一組置于相同環(huán)境中。
[0021](4)將等量的濃度為10 μ M的aptamer溶液加入電極，與目標(biāo)物OTC以及修飾在電極表面的BSA-OTC結(jié)合。
[0022](5)用PBS溶液洗滌電極，去掉游離的OTC目標(biāo)物。
[0023](6)加入環(huán)狀探針，aptamer尾部游離的引物沿著環(huán)狀探針開始進(jìn)行復(fù)制放大，放大產(chǎn)生的長鏈在亞甲基藍(lán)的存在下形成G四連體的結(jié)構(gòu)。亞甲基藍(lán)是一種電活性物質(zhì)，它能夠嵌入G四連體中，表示電信號的大小。
[0024]本發(fā)明的工作原理:
在玻碳電極上首先修飾增效物質(zhì)氧化石墨烯-金納米粒子，能促進(jìn)電極表面電子轉(zhuǎn)移。牛清血白蛋白BSA和土霉素的復(fù)合物修飾到電極上，與后來加入的目標(biāo)物土霉素形成對照。在加入aptamer后，aptamer優(yōu)先與游離的土霉素結(jié)合，剩余的aptamer再與固定在電極上的BSA-OTC結(jié)合，因而結(jié)合上的亞甲基藍(lán)個數(shù)較少，產(chǎn)生的電信號也較小。相反，不加入目標(biāo)物的一組，BSA-OTC復(fù)合物全部與aptamer結(jié)合，從而產(chǎn)生結(jié)合多個亞甲基藍(lán)，產(chǎn)生的電信號足夠大。通過亞甲基藍(lán)與電極發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電信號，連接電化學(xué)工作站，以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對電極，電位設(shè)置為-0.4到-0.1 V，脈沖寬度0.05V，脈沖寬度掃描為0.06 S，米用差分脈沖伏安技術(shù)讀取電信號的變化，根據(jù)電極表面產(chǎn)生的電流的大小起到對目標(biāo)物檢測的作用。
[0025]本發(fā)明的有益效果:
1、由于使用玻碳電極，其電極簡便、小型化、易攜帶、可多次使用。
[0026]2、反應(yīng)層是使用表面修飾技術(shù)固定在工作電極上，優(yōu)化使用材料的用量與濃度，制得的夾心型電極對環(huán)境溫度的要求不明顯，室溫下使用即可。
[0027]3、制備方法簡單，性能穩(wěn)定，電極的重復(fù)性好，適用于藥品安全中土霉素的檢測和生物傳感器產(chǎn)業(yè)化的實際應(yīng)用。
[0028]4、制作電極的工藝成本低，適用于產(chǎn)業(yè)化中價廉的要求。
[0029]5、以玻碳電極為固定載體固定基于核酸適配體的電化學(xué)傳感系統(tǒng)，可實現(xiàn)對藥品中土霉素的快速在線檢測。
[0030]6、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)是一種等溫信號擴(kuò)增方法，DNA可在很短時間內(nèi)實現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增。運用RCA復(fù)制技術(shù)就可實現(xiàn)指數(shù)滾環(huán)擴(kuò)增，具有快速、靈敏、特異性好的特點。
【具體實施方式】
[0032]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，下述說明僅是實例性的，不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0033]首先制備氧化石墨烯-金納米粒子復(fù)合物 1、氧化石墨稀-金納米粒子復(fù)合物的制備:
(I)氧化石墨烯(GO)的制備:
氧化石墨烯(GO)的制備是根據(jù)經(jīng)典的方法。簡而言之，1.0 g石墨粉加入到含有0.5g硝酸鈉(NaNO3)和3.0 g高錳酸鉀(KMnO4)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%的50 mL濃硫酸(H2SO4)中。溫度低于20 °0下，反應(yīng)I h，升溫到35°C，繼續(xù)攪拌30 min。然后緩慢加入約100 mL的離子水，持續(xù)攪拌20 min后，加入50 mL H2O2 (30%)，來還原殘留的氧化劑