動(dòng)物肺組織的取材和固定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及動(dòng)物組織的處理方法，具體涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺組織的取材和固定方法，以及所述方法的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]在肺損傷、肺臟疾病和藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)肺組織學(xué)結(jié)構(gòu)及正常肺組織結(jié)構(gòu)等研究中，常需要進(jìn)行組織學(xué)制片，并借助H.E染色或組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)、原位雜交等各種特殊染色，進(jìn)行光學(xué)顯微鏡觀察與研究。由于肺組織主要由肺內(nèi)支氣管的各級(jí)分支及其終端的大量肺泡組成，呈現(xiàn)含有大量氣體的海綿狀結(jié)構(gòu)等特殊性。如果和大多數(shù)臟器一樣采用取出后浸泡固定法固定，將會(huì)因?yàn)榉闻輧?nèi)外壓差的喪失以及制片過程中對(duì)肺組織的人為擠壓，導(dǎo)致光鏡下觀察到的肺組織呈現(xiàn)大片肺萎陷圖像，給觀察肺泡隔的細(xì)微結(jié)構(gòu)以及深入研究肺組織內(nèi)各種細(xì)胞的功能等研究帶來極大障礙。
[0003]為解決以上問題，目前OECD推薦采用心臟灌流固定法和氣管灌注固定法(0ECDGuidance Document on Histopathology for Inhalat1n Studies, 28September2009Draftl-36)。這兩種方法雖然部分解決了肺泡萎陷難題，但心臟灌流固定法使肺內(nèi)血管尤其是肺泡壁毛細(xì)血管過度擴(kuò)張，灌流后血管呈非生理狀態(tài)，原有的病變(如血細(xì)胞邊集、扣押等)遭到破壞，如灌流壓力過大還會(huì)造成肺毛細(xì)血管破裂；氣管灌注固定法從氣管內(nèi)灌注固定液，不可避免地將對(duì)肺泡壁產(chǎn)生過度擠壓，使肺泡喪失生理狀態(tài)下的組織結(jié)構(gòu)特征。此外因肺組織病變存留在肺泡內(nèi)的物質(zhì)，如炎性滲出物、蛋白水腫液等都將被固定液沖走或改變其分布。以上方法的缺陷均給肺組織的病理診斷與研究帶來了偏差甚至困難。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了解決上述問題，本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)和反復(fù)摸索，最終發(fā)現(xiàn)了一種操作簡便、同時(shí)能使肺臟處于自然擴(kuò)張狀態(tài)的肺組織取材與固定方法，由此完成了本發(fā)明。
[0005]本發(fā)明第一方面涉及動(dòng)物肺組織的取材和固定方法，其包括以下步驟:
[0006](I)結(jié)扎已死亡動(dòng)物的氣管，在結(jié)扎處遠(yuǎn)心端離斷氣管，將整個(gè)肺臟和結(jié)扎的氣管一起取出；
[0007](2)將步驟(I)獲得的整個(gè)肺臟進(jìn)行固定，得到固定的肺組織；優(yōu)選地，所述固定方法為將整個(gè)肺臟完全浸泡于固定液中。
[0008]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材和固定方法，其中所述動(dòng)物為哺乳動(dòng)物，例如為小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、兔、羊、馬、豬等。
[0009]在本發(fā)明中，所述動(dòng)物的處死方法優(yōu)選為能夠使肺臟保持自然擴(kuò)張狀態(tài)的方法，例如不會(huì)暴露胸腔，或者不會(huì)因?yàn)檫^度掙扎導(dǎo)致血液進(jìn)入肺組織(例如肺泡)。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述處死方法為麻醉后腹主動(dòng)脈放血處死。
[0010]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材和固定方法，其中步驟(I)在結(jié)扎氣管前，動(dòng)物胸腔的負(fù)壓狀態(tài)未被破壞。
[0011]在本發(fā)明中，所述胸腔的負(fù)壓狀態(tài)未被破壞是指未暴露或傷及胸腔，或者雖然暴露或傷及胸腔，但由呼吸機(jī)維持胸腔的負(fù)壓狀態(tài)。
[0012]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材和固定方法，其中所述將步驟(I)獲得的整個(gè)肺臟完全浸泡于固定液中的方法可以為本領(lǐng)域公知的任何可實(shí)現(xiàn)的方法，例如包括，在固定液液平面或肺組織表面覆蓋可以阻止肺組織浮出的物體、將重物與氣管連接或者為了避免對(duì)肺組織的破壞，可以選擇將肺組織與其它鄰近組織(例如心臟等)一并取出，小動(dòng)物可以其鄰近組織的重量使肺組織完全浸泡于固定液中，大動(dòng)物也可將重物與心臟連接。
[0013]在本發(fā)明中，所述重物是指該物體的重量足以使肺組織完全浸泡于固定液中，而且該重物不會(huì)被固定液腐蝕，不會(huì)影響肺組織的固定，不會(huì)破壞肺組織原有的生理或病理狀態(tài)。
[0014]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述重物與氣管連接。
[0015]根據(jù)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材或固定方法，其中所述固定液為本領(lǐng)域公知的組織固定液，例如為醛類溶液或醇類溶液，例如選自甲醛溶液、多聚甲醛溶液、乙醇溶液或者上述溶液的混合溶液，優(yōu)選地，所述甲醛溶液或多聚甲醛溶液的濃度約為4%。
[0016]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述固定液為4%中性甲醛溶液。
[0017]在本發(fā)明中，所述固定肺組織的方法為本領(lǐng)域所公知，例如可采用化學(xué)方法，如采用各種化學(xué)溶液做固定液。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述固定肺組織的方法為采用固定液的方法。
[0018]在本發(fā)明中，所述固定肺組織的時(shí)間為本領(lǐng)域所公知，例如可根據(jù)選擇的固定液不同確定相應(yīng)的固定時(shí)間；在本發(fā)明的實(shí)施方案中，固定肺組織的時(shí)間為24小時(shí)。
[0019]在本發(fā)明中，所述肺組織為健康肺組織或處于病理狀態(tài)的肺組織。
[0020]本發(fā)明第二方面涉及按照本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的方法制備得到的動(dòng)物肺組織。
[0021]本發(fā)明第三方面涉及肺組織切片的制備方法，其包括本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材或固定方法，以及任選的將固定后的肺組織進(jìn)行制片的步驟。
[0022]在本發(fā)明中，將固定后的肺組織進(jìn)行制片的方法為本領(lǐng)域所公知，例如可采用將固定后的肺組織進(jìn)行包埋再制片，或者將固定后的肺組織進(jìn)行冰凍切片的方法。
[0023]在本發(fā)明中，將固定后的肺組織進(jìn)行包埋的方法為本領(lǐng)域所公知，例如為石蠟包埋或塑料包埋。
[0024]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，采用石蠟包埋的方法。
[0025]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述石蠟包埋包括脫水、透明、浸蠟等步驟。
[0026]在本發(fā)明中，將包埋后的組織塊進(jìn)行制片(或切片)的方法為本領(lǐng)域所公知，所述切片的厚度根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，采用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度為3 μ m。
[0027]在本發(fā)明中，對(duì)組織切片進(jìn)行染色的方法為本領(lǐng)域所公知。例如HE染色、Trichrome染色，天狼星紅染色、Van GiesonJ s染色、免疫組化等等。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，對(duì)組織切片采用HE染色(蘇木精-伊紅染色)。
[0028]本發(fā)明第四方面涉及根據(jù)本發(fā)明第三方面任一項(xiàng)的制備方法制備得到的肺組織切片。
[0029]本發(fā)明還涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的取材或固定方法用于確定離體肺組織的病理類型或病理狀態(tài)的用途，或者用于藥物的非臨床研究試驗(yàn)的用途。
[0030]發(fā)明的有益效果
[0031]本發(fā)明提供了動(dòng)物肺組織的取材和固定方法，其操作簡便，解決了肺泡萎陷和擴(kuò)張等人工假像；與常規(guī)浸入固定法、氣管灌注固定法、心臟灌流固定法相比，具有肺泡結(jié)構(gòu)完整清楚，肺泡壁毛細(xì)血管內(nèi)的紅細(xì)胞無溢出現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)；利用該方法制備的組織切片能夠保持肺組織的原有生理、病理狀態(tài)，并且保持肺泡和血管的自然擴(kuò)張狀態(tài)，為肺組織病變的診斷(如肺水腫、肺大皰、肺不張與炎細(xì)胞滲出等)與研究奠定了良好的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。本發(fā)明的方法可廣泛應(yīng)用于肺臟的組織學(xué)以及肺臟疾病的組織病理學(xué)與病理機(jī)制研究中，在藥物非臨床研究中也具有重要的實(shí)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0032]圖1大鼠麻醉后仰臥位置于解剖臺(tái)上，暴露腹腔，腹主動(dòng)脈放血處死。剪開胸頸部皮膚，鈍性分離出氣管。注意務(wù)必不要傷及胸壁結(jié)構(gòu)，以免破壞胸腔負(fù)壓。
[0033]圖2在大鼠甲狀軟骨下結(jié)扎氣管，注意扎死，不能有漏氣發(fā)生。
[0034]圖3完整分離大鼠肺臟的腹側(cè)觀，因暴露胸腔前結(jié)扎氣管，肺內(nèi)充盈氣體，故肺呈膨隆狀。肺臟分離過程如下:在結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪斷氣管，小心暴露胸腔并取下胸腺與心臟，用鑷子提起氣管由上至下鈍性分離出全肺(注意避免傷及各個(gè)肺葉)，自橫膈上剪斷食道，取出肺臟。在氣管斷端連一重物。
[0035]圖4完整分離大鼠肺臟的背側(cè)觀，注意肺臟呈膨隆狀。
[0036]圖5在氣管處系一重物，使大鼠肺臟潛浮固定于4%中性甲醛液體中。
[0037]圖6大鼠肺臟組織石蠟切片，HE染色。示包含全部5葉肺臟切片的全景照片，可見各肺葉肺泡均呈自然擴(kuò)張狀態(tài)，圖中一小格為2.5mm。
[0038]圖7圖6局部放大觀，示肺組織各級(jí)肺泡(肺泡囊、肺泡管與肺泡)結(jié)構(gòu)呈自然擴(kuò)張狀態(tài)，未見肺泡陷落或過度擴(kuò)張，圖中一小格為0.25mm。
[0039]圖8圖7進(jìn)一步放大觀，示肺泡自然擴(kuò)張，肺泡隔菲薄，圖中一小格為100 μ m。
[0040]圖9小鼠麻醉后仰臥位置于解剖臺(tái)上，暴露腹腔，腹主動(dòng)脈放血處死。剪開胸頸部皮膚，鈍性分離出氣管。注意務(wù)必不要傷及胸壁結(jié)構(gòu)，以免破壞胸腔負(fù)壓。
[0041]圖10在甲狀軟骨下結(jié)扎氣管，注意扎死，不能有漏氣發(fā)生。
[0042]圖11完整分離小鼠肺臟的腹側(cè)觀，因暴露胸腔前結(jié)扎氣管，肺內(nèi)充盈氣體，故肺呈膨隆狀。肺臟分離過程如下:在結(jié)扎處遠(yuǎn)心端剪斷氣管，小心暴露胸腔并取下胸腺與心臟，用鑷子提起氣管由上至下鈍性分離出全肺(注意避免傷及各個(gè)肺葉)，自橫膈上剪短食道，取出肺臟。在氣管斷端連一重物。
[0043]圖12完整分離小鼠肺臟的背側(cè)觀，注意肺臟呈膨隆狀。
[0044]圖13