D二聚體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】D 二聚體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)免疫學(xué)中熒光免疫層析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種能夠快速準(zhǔn)確的對(duì)D 二聚體進(jìn)行定量分析的D 二聚體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0003]D 二聚體(D-Dimer)來(lái)源于纖溶酶溶解的交聯(lián)纖維蛋白凝塊，是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子X(jué)IIIa交聯(lián)后再經(jīng)纖溶酶水解產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，是一個(gè)特異性的纖溶過(guò)程標(biāo)記物。
[0004]在生理狀態(tài)下，機(jī)體保持著凝血與纖溶動(dòng)態(tài)平衡，以保證纖維蛋白及時(shí)形成和清除，而人體正常D 二聚體的水平一般在200μ g/Ι以下，如果體內(nèi)凝血和纖溶系統(tǒng)雙重激活，D 二聚體水平就會(huì)升高，因此D 二聚體可以作為體內(nèi)高凝狀態(tài)和纖溶亢進(jìn)的分子標(biāo)志物之一。D 二聚體的特異性反映的是有凝血和纖溶過(guò)程的這一類(lèi)疾病的共同病理特點(diǎn)，因此在臨床應(yīng)用十分廣泛。D 二聚體作為測(cè)定纖溶系統(tǒng)的主要因子，對(duì)于診斷與治療纖溶系統(tǒng)疾病及與纖溶系統(tǒng)有關(guān)的疾病以及溶栓治療檢測(cè)有著重要的意義，因此D 二聚體是深靜脈血栓(DVT)，肺栓塞(PE)，彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)的關(guān)鍵指標(biāo)。由此可見(jiàn)，血液中D 二聚體含量測(cè)定對(duì)血栓性疾病的早期診斷、病程監(jiān)測(cè)以及對(duì)溶栓藥物的治療監(jiān)測(cè)等都具有重要的臨床意義。
[0005]目前，針對(duì)D二聚體的檢測(cè)方法主要有膠乳凝集法，雙抗夾心法(ELISA)、免疫金標(biāo)法、膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法等。乳膠凝集法簡(jiǎn)單快速，適用于即時(shí)檢驗(yàn)(point-of-caretesting, P0CT)，但是只能用于定性測(cè)定，大多用于篩查；ELISA法靈敏度高，但定量準(zhǔn)確性差、操作時(shí)間長(zhǎng)、自動(dòng)化程低，不適合POCT的需要；膠乳顆粒增強(qiáng)免疫比濁法(PETIA)可以很方便的應(yīng)用于全自動(dòng)生化儀，但是需要儀器，耗時(shí)較長(zhǎng)，適合處理大量樣本，對(duì)于急診科和基層醫(yī)院，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的目的；免疫金標(biāo)法與乳膠凝集法類(lèi)似，具有操作簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn)，但是同樣定量準(zhǔn)確性差，特別是重復(fù)性差這一缺點(diǎn)限制了其在臨床上的應(yīng)用，尤其不適用于需通過(guò)準(zhǔn)確定量來(lái)幫助對(duì)疾病進(jìn)行診斷的體液標(biāo)志蛋白的定量檢測(cè)。因此開(kāi)發(fā)定量準(zhǔn)確、快捷方便的D 二聚體檢測(cè)產(chǎn)品，仍是臨床診斷產(chǎn)品研究領(lǐng)域亟需解決的重要問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)和不足，提出了一種利用熒光免疫層析的靈敏性，結(jié)合熒光免疫層析分析儀實(shí)現(xiàn)的靈敏度高、快捷簡(jiǎn)便，可以準(zhǔn)確定量的D 二聚體檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0007]本發(fā)明可以通過(guò)以下措施達(dá)到:
一種D 二聚體檢測(cè)試劑盒，設(shè)有試紙卡，其特征在于所述試紙卡由下至上依次設(shè)有:PVC板、樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，其中結(jié)合墊上吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為60-120nm，稀土熒光微球摻雜稀土鑭系元素，在基態(tài)下穩(wěn)定，在340-380nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)范圍在540_600nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來(lái)源于針對(duì)2-6個(gè)不同的D二聚體抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株。
[0008]本發(fā)明所述結(jié)合墊的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是70_90nm ;所述稀土熒光微球優(yōu)選摻雜有稀土鑭系元素，為銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)等鑭系元素的任意一種或幾種的混合物；所述稀土熒光微球優(yōu)選摻雜稀土絡(luò)合物；結(jié)合墊上稀土熒光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來(lái)源于針對(duì)2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株。
[0009]本發(fā)明所述結(jié)合墊采用如下步驟制得:將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0% Triton X-100,2.5%BSA, ρΗ7.4)，4°C浸泡2小時(shí)，然后取出37°C烘箱烘干4小時(shí)，備用，將玻璃纖維膜在B1-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用B1-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體噴到玻璃纖維膜，37°C烘干I小時(shí)后制得。
[0010]本發(fā)明中結(jié)合墊上的所述稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體采用如下步驟制得:
步驟1:單克隆抗體細(xì)胞株的獲得:用D 二聚體純品免疫小鼠，采用標(biāo)準(zhǔn)的單克隆抗體制備方法制備特異性高親和力的單克隆抗體細(xì)胞株，對(duì)所獲得的單抗細(xì)胞株進(jìn)行配對(duì)篩選，根據(jù)配對(duì)結(jié)果和親和力數(shù)據(jù)優(yōu)選出用于試劑盒的單抗細(xì)胞株；
步驟2:單克隆抗體的制備:采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化D 二聚體單克隆抗體，分裝后保存于_20°C備用；
步驟3:稀土熒光微球的醛基化:取5mg稀土熒光微球，用20mM，pH 9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗漆3遍,離心速度為12000rpm,時(shí)間為5分鐘,最后重懸于100 μ I的上述碳酸鹽緩沖液中，加入500 μ I醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)，采用同樣的離心法洗滌和重懸到100μ I的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4°C備用；
步驟4:稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體的制備:選取來(lái)自2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株的單克隆抗體，按照質(zhì)量比1:1將2mg D 二聚體單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4°C透析過(guò)夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4°C反應(yīng)過(guò)夜；然后，加入硼氫化鈉至終濃度5mM，4°C反應(yīng)4小時(shí)；再加入等體積的封閉液(50mM Tris-HCL,pH7.4，含2%BSA，5%蔗糖)，4°C封閉過(guò)夜；然后用50mM Tris-HCL, pH7.4的緩沖液采用離心法洗滌 3 遍，重懸于 100 μ I 的 50mM Tris-HCL 緩沖液中(含 1.2%NaCL, 0.5%BSA, 0.l%Tween20)，4°C避光保存?zhèn)溆谩?br>[0011]本發(fā)明所述包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜通過(guò)以下步驟制得:
步驟1:采用與結(jié)合墊上所用D 二聚體單克隆抗體細(xì)胞株不同的細(xì)胞株，采用標(biāo)準(zhǔn)的腹水生產(chǎn)工藝制備并純化D 二聚體單克隆抗體，保存于-20°C備用；
步驟2:分別用包被稀釋液將上述D 二聚體單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體調(diào)整濃度到l_5mg/ml，膜液量為1_2 μ 1/cm，將它們分別作為檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，檢測(cè)線和質(zhì)控線間隔為3-7_，然后置于烘箱中，37°C烘干2小時(shí)。
[0012]本發(fā)明所述樣品墊通過(guò)以下步驟制得:將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0%TritonX-100,2.5% BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4°C浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37°C烘干2小時(shí)。
[0013]本發(fā)明還提供了一種如上所述試劑盒實(shí)現(xiàn)的D 二聚體檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟:
步驟1:將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；
步驟2:精確吸取10 μ I血清樣本，樣本為全血時(shí)吸取20 μ I樣本，加入到樣本孔中，再立即在下部的緩沖液孔中加入150 μ I樣本稀釋液，樣本稀釋液采用生理鹽水或PBS，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；
步驟3:設(shè)置好熒光免疫層析分析儀的相關(guān)參數(shù)后，將試紙卡放入倉(cāng)內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果，所述熒光免疫層析分析儀是一種光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)，對(duì)D二聚體的檢測(cè)范圍為0.1-10.0mg/Lo
[0014]本發(fā)明提供一種利用稀土熒光免疫層析技術(shù)制備的D 二聚體快速定量免疫層析檢測(cè)試劑盒，同時(shí)適合血清和全血樣本，并適合臨床上單人份檢測(cè)，相對(duì)于D 二聚體定性膠體金試劑，能定量檢測(cè)樣本中的D 二聚體含量，具有更明確的臨床指導(dǎo)意義，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
[0015]【附圖說(shuō)明】:
附圖1是本發(fā)明中試紙卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0016]附圖2是本發(fā)明中實(shí)施例2的準(zhǔn)確度分析結(jié)果示意圖。
[0017]附圖標(biāo)記:PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4、吸水墊5。
[0018]【具體實(shí)施方式】:
下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明:
如附圖1所示，本發(fā)明首先提出了一種D 二聚體檢測(cè)試劑盒，盒內(nèi)設(shè)有試紙卡，所述試紙卡由下至上依次設(shè)有=PVC板1、樣品墊2、結(jié)合墊3、硝酸纖維素膜4和吸水墊5，其中結(jié)合墊3上吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體，所述稀土熒光微球的直徑為60-120nm,稀土突光微球摻雜稀土鑭系元素,在基態(tài)下穩(wěn)定,在340_380nm的激發(fā)光源作用下發(fā)射出波長(zhǎng)范圍在540-600nm的熒光；所述單克隆抗體為純化后混合的單克隆抗體，來(lái)源于針對(duì)2-6個(gè)不同的D 二聚體抗原表位的單克隆抗體細(xì)胞株；
所述結(jié)合墊3的稀土熒光微球的直徑優(yōu)選是70-90nm ;所述稀土熒光微球優(yōu)選摻雜有稀土鑭系元素，為銪(Eu)、釤(Sm)、鉺(Er)、釹(Nd)等鑭系元素的任意一種或幾種的混合物；所述稀土突光微球優(yōu)選摻雜稀土絡(luò)合物；結(jié)合墊上稀土突光微球標(biāo)記的抗體優(yōu)選來(lái)源于針對(duì)2個(gè)不同抗原表位的單克隆細(xì)胞細(xì)胞株。
[0019]實(shí)施例1:
D二聚體檢測(cè)試劑盒中試紙卡的各組成部分可以通過(guò)以下措施制得:
1、樣品墊2的制備:
將玻璃纖維膜浸泡于含有1.0%Triton X-100,2.5% BSA，0.15M Tris緩沖液，pH7.5的處理液中，于4°C浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37°C烘干2小時(shí)。
[0020]2、吸附熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊3的制備:
將玻璃纖維膜浸泡于150mM Tris-HCL處理液中(含1.0% Triton X-100,2.5%BSA,pH7.4)，4°C浸泡2小時(shí)，然后取出37 °C烘箱烘干4小時(shí)，備用。將玻璃纖維膜在B1-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用B1-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記的D 二聚體單克隆抗體噴到玻璃纖維膜，37°C烘干I小時(shí)，備用；
稀土熒光納米微球的醛基化:取5mg稀土熒光納米微球，用20mM，pH9.5的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗漆3遍,離心速度為12000rpm,時(shí)間為5分鐘,最后重懸于100 μ I的上述碳酸鹽緩沖液中，