Vegf-c在制備敗血癥及重癥細(xì)菌感染診斷試劑中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉生物醫(yī)學(xué)及疾病診斷領(lǐng)域，具體涉及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C在制備敗血 癥及重癥細(xì)菌感染檢測(cè)試劑中的應(yīng)用及其相關(guān)診斷試劑。
【背景技術(shù)】
[0002] 天然免疫（innate immunity)作為機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體受到病 原微生物入侵時(shí)，迅速發(fā)揮免疫應(yīng)答反應(yīng)，是機(jī)體清除病原微生物的關(guān)鍵防御系統(tǒng)。但過(guò)度 活化或持續(xù)性炎癥反應(yīng)也會(huì)引起嚴(yán)重的機(jī)體損傷和相關(guān)炎癥性疾病，如細(xì)菌等病原微生物 感染引起的敗血癥（Sepsis)。敗血癥或敗血癥休克（septic shock)都是臨床上常見(jiàn)的急 危重癥，死亡率高，至今臨床上仍缺乏療效高、副作用小的方法。細(xì)菌感染是敗血癥休克最 常見(jiàn)的病因，細(xì)菌的產(chǎn)物包括內(nèi)毒素，外毒素和細(xì)菌外壁成分LPS可直接或間接地刺激單 核細(xì)胞、多形核中性粒白細(xì)胞或巨噬細(xì)胞細(xì)胞等淋巴細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量的促炎 細(xì)胞因子（proinflammatory cytokine)，如 TNF-a，IL-6, IL-1 β 等。
[0003] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-(XVascular endothelial growth factor-C, VEGF-C)是VEGF 家族成員，作為配體，特異性結(jié)合血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體家族成員VEGFR-2和VEGFR-3。 VEGF-C和其受體的結(jié)合能夠?qū)е率荏w分子之間形成同型或異型二聚體，促進(jìn)受體的自磷酸 化，進(jìn)而招募下游信號(hào)分子和傳遞信號(hào)。VEGF-C與其受體通過(guò)影響血管或淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞 的生長(zhǎng)、生存和遷移等功能，在生理和病理?xiàng)l件下的血管和淋巴管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作 用。
[0004] VEGF-C主要由內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞分泌。最近研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等 也能夠產(chǎn)生VEGF-C。腫瘤部位高表達(dá)的VEGF-C通過(guò)促進(jìn)腫瘤相關(guān)淋巴管生成而導(dǎo)致腫瘤 的轉(zhuǎn)移。通過(guò)針對(duì)VEGF/VEGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的不同治療策略，如靶向VEGF-C受體的可溶性 抗體、可溶性誘餌受體或抑制劑，能夠降低腫瘤的轉(zhuǎn)移。外周血中有VEGF家族成員存在，并 且伴隨一些疾病的發(fā)生，其在外周血中含量相應(yīng)變化，是這些疾病的潛在診斷標(biāo)志物。如血 清中 VEGF-A 的含量與胃癌轉(zhuǎn)移的（Oh, S. Y.，H. C. Kwon, et al. (2008) · 〃Clinicopathologic significance of HIF-Ialphaj p53, and VEGF expression and preoperative serum VEGF level in gastric cancer. 〃BMC Cancer8:123.)，血清 VEGF-C 含量作為中晚期宮 頸癌的特異性診斷標(biāo)志物（Mathur，S. Ρ·，R. S. Mathur，et al. (2005). 〃Serum vascular endothelial growth factor C (VEGF-C)as a specific biomarker for advanced cervical cancer: Relationship to insulin-like growth factor II (IGF-II), IGF binding protein3 (IGF-BP3)and VEGF-A[corrected]. ^Gynecol 0ncol98(3):467-483.), 血清VEGF-C含量作為卵巢癌病人的診斷和預(yù)后標(biāo)志物（Cheng，D.，B. Liang，et al. (2013) ·''Serum vascular endothelial growth factor (VEGF-C) as a diagnostic and prognostic marker in patients with ovarian cancer. 〃PLoS 0ne8 (2) : e55309.)等。
[0005] 敗血癥是細(xì)菌等病原微生物侵入血液循環(huán)并在其中生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生毒素，引起嚴(yán) 重的免疫反應(yīng)，造成全身性、多器官感染的疾病。敗血癥或重癥細(xì)菌感染促使機(jī)體發(fā)生不可 控的急性炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致人體器官功能受損或衰竭和多系統(tǒng)發(fā)生中毒癥狀，如皮膚、粘膜系 統(tǒng)壞死、呼吸系統(tǒng)不規(guī)則，中樞神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血管系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)炎癥、泌尿系統(tǒng) 感染等，進(jìn)而導(dǎo)致死亡。在免疫力低下者如兒童，新生兒和老年人中易發(fā)。同時(shí)，敗血癥也是 醫(yī)院內(nèi)，尤其在重癥監(jiān)護(hù)病房（I⑶)，死亡率較高的一種因素。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年有750, OOO 人感染敗血癥（Angus and Wax, 2001)，其中28%-50%患者死于敗血癥，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于死于前列腺 癌、乳腺癌和艾滋病的總?cè)藬?shù)。敗血癥發(fā)生的早期及時(shí)診斷和監(jiān)測(cè)性用藥對(duì)于其治療至關(guān) 重要。目前敗血癥或重癥細(xì)菌感染的檢查主要靠細(xì)菌學(xué)方法，通過(guò)采血做血液細(xì)菌培養(yǎng)的 方法或者通過(guò)病原菌抗原及DNA檢測(cè)確定是否為感染。但細(xì)菌學(xué)方法存在耗時(shí)長(zhǎng)和假陽(yáng)性 的弱點(diǎn)，對(duì)及時(shí)診斷和用藥產(chǎn)生很大的局限。因而，發(fā)展新的靈敏、快速、高效輔助敗血癥或 重癥細(xì)菌感染的診斷或監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展的方法，對(duì)于臨床及時(shí)診斷和治療至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種快速診斷敗血癥或快速診斷嚴(yán) 重細(xì)菌感染的方法，從而實(shí)現(xiàn)敗血癥及嚴(yán)重細(xì)菌感染患者的及時(shí)用藥；并且本發(fā)明還可用 于監(jiān)測(cè)患者的病程進(jìn)展，以便于調(diào)整藥量，防止臨床上抑菌藥物的濫用，極具臨床價(jià)值及應(yīng) 用前景。
[0007] 本發(fā)明首先公開(kāi)了 VEGF-C (Vascular endothelial growth factor-C，血管內(nèi)皮 生長(zhǎng)因子-C)在制備敗血癥或重癥細(xì)菌感染診斷及病程監(jiān)測(cè)試劑中的用途。
[0008] 較優(yōu)的，所述VEGF-C為生物標(biāo)志物。
[0009] 更優(yōu)的，所述VEGF-C為血清生物標(biāo)志物。
[0010] 本發(fā)明公開(kāi)了 VEGF-C作為血清生物標(biāo)志物診斷及監(jiān)測(cè)敗血癥、重癥細(xì)菌感染的 新用途，可將VEGF-C用于制備敗血癥診斷試劑，敗血癥病程監(jiān)測(cè)試劑，重癥細(xì)菌感染診斷 試劑，或者重癥細(xì)菌感染病程監(jiān)測(cè)試劑。
[0011] 本發(fā)明第二方面公開(kāi)了 VEGF-C，與VEGFR-3和/或IL-6,在制備敗血癥或重癥細(xì) 菌感染診斷及病程監(jiān)測(cè)試劑中的用途。
[0012] 較優(yōu)的，所述VEGF-C，IL-6以及VEGFR-3為生物標(biāo)志物。
[0013] 本發(fā)明所述 VEGF-C，與 VEGFR-3 和 / 或 IL-6,，包括 VEGF-C 與 IL-6, VEGF-C 與 VEGFR-3, VEGF-C與IL-6和VEGFR-3共三種情況。即VEGF-C可以聯(lián)合其受體VEGFR-3,以 及現(xiàn)有的敗血癥檢測(cè)指標(biāo)IL-6,進(jìn)行敗血癥及重癥細(xì)菌感染的檢測(cè)和監(jiān)控，制備敗血癥及 重癥細(xì)菌感染測(cè)、病程監(jiān)測(cè)試劑。
[0014] 本發(fā)明所述VEGF-C、IL-6和VEGFR-3均為已知蛋白，例如VEGF-C為血管內(nèi)皮生長(zhǎng) 因子-C，人VEGF-C的蛋白序列可參考GenBank :CAA63907. 1。
[0015] 本發(fā)明通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，與健康人或動(dòng)物相比，敗血癥患者或重癥細(xì)菌感染患者外 周血的血清中VEGF-C含量顯著增高，與敗血癥或重癥細(xì)菌感染正相關(guān)，并與病程發(fā)展相 關(guān)；并且，與健康人群或動(dòng)物相比，病患血清中IL-6的含量和巨噬細(xì)胞表面VEGFR-3的表達(dá) 水平也顯著增高。IL-6是一種已知與敗血癥密切相關(guān)的細(xì)胞因子，其在血清中的含量已經(jīng) 作為一種靈敏性與特異性較高的、診斷敗血癥的方法；VEGFR-3的表達(dá)水平升高是本發(fā)明 新發(fā)現(xiàn)的。因此，IL-6與VEGFR-3可以作為一種輔助性檢測(cè)指標(biāo)，結(jié)合血清中VEGF-C的含 量，成為臨床上敗血癥或重癥細(xì)菌感染的診斷、監(jiān)測(cè)或預(yù)后的重要生物學(xué)標(biāo)志物。
[0016] 本發(fā)明第三方面公開(kāi)了一種敗血癥或重癥細(xì)菌感染診斷及病程監(jiān)測(cè)試劑盒，所述 試劑盒包括VEGF-C蛋白ELISA檢測(cè)試劑。
[0017] 進(jìn)一步的，所述VEGF-C蛋白ELISA檢測(cè)試劑包括VEGF-C-抗，以及酶標(biāo)記的 VEGF-C 二抗。
[0018] 較優(yōu)的，所述酶為辣根過(guò)氧化物酶（HRP)。
[0019] 所述VEGF-C蛋白因子ELISA檢測(cè)試劑還包括酶所對(duì)應(yīng)的底物。
[0020] 進(jìn)一步的，所述敗血癥或重癥細(xì)菌感染診斷及病程監(jiān)測(cè)試劑盒還包括VEGFR-3表 達(dá)水平檢測(cè)試劑和/或IL-6蛋白ELISA檢測(cè)試劑。
[0021] 較優(yōu)的，所述IL-6蛋白ELISA檢測(cè)試劑包括IL-6 -抗，以及酶標(biāo)記的IL-6二抗； 所述VEGFR-3表達(dá)水平檢測(cè)試劑為VEGFR-3熒光免疫試劑，或者所述VEGFR-3表達(dá)水平檢 測(cè)試劑為VEGFR-3逆轉(zhuǎn)錄試劑。前述二抗為與一抗具有不同抗原表位的抗體，能夠形成一 抗-目標(biāo)蛋白-二抗的雙抗體夾心結(jié)構(gòu)。
[0022] 更優(yōu)的，所述VEGFR-3熒光免疫試劑包括VEGFR-3抗體，以及熒光基團(tuán)標(biāo)記的抗 VEGFR-3抗體(抗VEGFR-3抗體是指抗前述VEGFR-3抗體的抗體，其能夠特異性結(jié)合前述 VEGFR-3抗體）；所述VEGFR-3逆轉(zhuǎn)錄試劑包括SEQ ID NO: 1-2所示序列的引物。
[0023] 本發(fā)明所采用的熒光基團(tuán)可以為現(xiàn)有技術(shù)的任意一種熒光基團(tuán)，例如可以