心肌肌鈣蛋白i超敏檢測(cè)試劑盒及超敏檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生化物質(zhì)的檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種心肌肌鈣蛋白I超敏檢測(cè)試劑盒 及其制備方法，還涉及一種心肌肌鈣蛋白I超敏檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肌鈣蛋白是橫紋肌收縮的調(diào)節(jié)蛋白，存在于心肌和骨骼肌中，由三種亞基組成，分 別為TnI、TnC和TnT。三種亞基形成復(fù)合物，在肌肉收縮和舒張過(guò)程中起著重要調(diào)節(jié)作用。 TnI為肌動(dòng)蛋白的抑制亞基，有三種亞型：快骨骼肌亞型（fTnl)、慢骨骼肌亞型（sTnl)和心 肌亞型（心肌肌鈣蛋白I，cTnl)。其中心cTnl分子質(zhì)量23. 9kD，包含有210個(gè)氨基酸殘 基。cTnl含量升高可作為診斷急性心肌梗死（AMI)的重要血清學(xué)指標(biāo)。發(fā)生急性心肌梗塞 時(shí)，cTnl由于心肌受到障礙在4-8小時(shí)內(nèi)被釋放到血液中，因此其濃度脫離健康人的濃度 范圍。通常，AMI發(fā)病后12-18小時(shí)后，cTnl濃度達(dá)到最高，并且維持5-10日。
[0003] 急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。臨床上多有 劇烈而持久的胸骨后疼痛，靠休息以及硝酸酯類藥物不能完全緩解，伴有血清心肌酶活性 增高及進(jìn)行性心電圖變化，可并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，甚至危及生命，是心內(nèi)科的 常見(jiàn)疾病之一，嚴(yán)重危害人類健康。此病在歐美最常見(jiàn)，美國(guó)每年約有150萬(wàn)人發(fā)生心肌梗 死。中國(guó)近年來(lái)呈明顯上升趨勢(shì)，每年新發(fā)病人數(shù)至少50萬(wàn)，現(xiàn)患至少200萬(wàn)。近年來(lái)AMI 在治療上取得很大發(fā)展，從消極的保守治療轉(zhuǎn)為積極的消除血栓或經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈擴(kuò)張術(shù)乃 至進(jìn)行冠狀動(dòng)脈搭橋術(shù)治療。這就對(duì)早期準(zhǔn)確診斷出AMI提出了很高的要求，但AMI發(fā)作 時(shí)敏感性只有50 %左右，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，敏感性逐步提高，至6h敏感性可達(dá)90 %以上，表 現(xiàn)出隨著時(shí)間推移敏感性逐漸升高的趨勢(shì)，意味著早期準(zhǔn)確診斷出AMI的關(guān)鍵問(wèn)題是提高 檢測(cè)方法的靈敏度。
[0004] 目前,AMI的檢測(cè)方法主要有特征性心電圖衍變以及血清生物標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化。 但是，約有25%的心肌梗死患者發(fā)病早期沒(méi)有典型的臨床癥狀，約50%左右的AMI患者缺 乏心電圖的特異改變，若單獨(dú)依靠心電圖改變和臨床癥狀，AMI的診斷符合率僅為75%。在 這種情況下，心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)在診斷AMI時(shí)尤為重要。心肌損傷標(biāo)志物主要為肌酸 激酶同工酶（CK-MB)及cTnl。其中，由于cTnl具有心肌損傷后動(dòng)態(tài)釋放迅速、曲線完整、峰 值明顯、組織特異性強(qiáng)、窗口診斷期長(zhǎng)、測(cè)定方法快、血中出現(xiàn)早等優(yōu)點(diǎn)，基于cTnl對(duì)AMI的 診斷方式優(yōu)于基于CK-MB對(duì)AMI的診斷方式，因此已被臨床廣泛接受。cTnl不僅成為診斷 急性心肌梗死的"金標(biāo)準(zhǔn)"，而且已成為心肌疾病病情監(jiān)測(cè)、療效觀察、危險(xiǎn)分級(jí)及預(yù)后評(píng)估 的最合適標(biāo)志物。
[0005] cTnl的測(cè)定方法很多，主要有放射性同位素免疫分析法（RIA)、酶聯(lián)免疫吸附試 驗(yàn)法（ELISA)、以及膠體金免疫層析法（ICA)等。近年來(lái)，隨著對(duì)cTnl研究的發(fā)展，一些新 的更加準(zhǔn)確的檢測(cè)方法在臨床檢驗(yàn)科中得以開(kāi)展，如化學(xué)發(fā)光法（CLIA)。
[0006] 放射性同位素免疫分析法法因其存在著操作繁瑣、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、不適合大批量檢 測(cè)、結(jié)果重復(fù)性差、核素污染等問(wèn)題，已基本不使用。
[0007] 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法的測(cè)定原理是以包被固相載體的特異性抗體為第一抗體，加 入待測(cè)血清后，再加入生物素標(biāo)記的第二抗體，形成雙夾心，孵育后沖洗分離，加入發(fā)光基 質(zhì)底物，測(cè)得的光強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比可得cTnl的濃度值。然而，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法存 在著操作繁瑣、測(cè)定周期偏長(zhǎng)、靈敏度相對(duì)較低、線型范圍偏窄等諸多不足；尤其是，由于 cTnl血清含量偏低，采用ELISA法檢測(cè)cTnL表現(xiàn)出明顯的靈敏度較差的問(wèn)題，使臨床無(wú)法 在早期快速準(zhǔn)確的診斷出AMI發(fā)作，因而限制了 ELISA法在cTnl臨床檢測(cè)方面的進(jìn)一步應(yīng) 用。
[0008] 膠體金免疫層析法標(biāo)本用量少，簡(jiǎn)便快速，適合于cTnl的床旁檢測(cè)。其基本原理 均是利用兩個(gè)抗cTnl單克隆抗體的結(jié)合來(lái)檢測(cè)cTnl，當(dāng)血清樣本滴到吸收孔內(nèi)，第一個(gè)被 膠體金標(biāo)記的抗體與cTnl結(jié)合形成一個(gè)抗體抗原復(fù)合物，第二個(gè)固定化的cTnl單抗捕捉 到這個(gè)結(jié)合體，產(chǎn)生一個(gè)粉色的條帶，對(duì)于無(wú)結(jié)合體的存在，反應(yīng)圈內(nèi)則沒(méi)有色帶。但膠體 金免疫層析法僅能進(jìn)行定性測(cè)定，對(duì)于定量測(cè)定則靈敏度很差?；谀z體金免疫層析法開(kāi) 發(fā)的檢測(cè)卡，雖然可快速完成cTnl定性檢測(cè)，但同樣由于靈敏度較低的問(wèn)題，在AMI早期， 血清中僅含有少量cTnl的情況下，膠體金免疫層析法無(wú)法準(zhǔn)確診斷出AMI的發(fā)作，所以在 臨床應(yīng)用上還是有很大的局限性。
[0009] 化學(xué)發(fā)光法是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來(lái)的一種檢測(cè)微量抗原或 抗體的標(biāo)記免疫分析技術(shù)，包含兩個(gè)部分，即免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)。化學(xué)發(fā)光 分析系統(tǒng)是利用化學(xué)發(fā)光物質(zhì)，經(jīng)催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個(gè)激發(fā)態(tài)的中間 體，當(dāng)這種激發(fā)態(tài)中間體回到穩(wěn)定的基態(tài)時(shí)，同時(shí)發(fā)射出光子，利用發(fā)光信號(hào)測(cè)量?jī)x器測(cè)量 光量子產(chǎn)額。免疫反應(yīng)系統(tǒng)是將標(biāo)記物質(zhì)直接標(biāo)記在抗原或抗體上，經(jīng)過(guò)特異性反應(yīng)后形 成抗原-抗體復(fù)合物，然后進(jìn)行相應(yīng)標(biāo)記物的檢測(cè)方法檢測(cè)。CLIA的主要優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、 線性范圍寬、標(biāo)記物的有效期長(zhǎng)、無(wú)放射性危害、可實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化等。
[0010] Siemens公司提供的CTnI檢測(cè)試劑盒包含RcadyPackli主試劑包，含ADVIA Cental^超敏Tnl?二元標(biāo)記試劑、固相試劑和輔助試劑。二元標(biāo)記試劑包括吖啶酯標(biāo)記 的山羊多克隆抗cTnl抗體（~0. 15yg/mL)，2個(gè)生物素標(biāo)記的鼠單克隆抗cTnl抗體（~ 2.0 μ g/mL);固相試劑為乳膠磁性顆粒懸浮液；輔助試劑為非磁性乳膠顆粒。該公司的 ADVIA Centaur超敏TnI檢測(cè)法是采用直接化學(xué)發(fā)光技術(shù)的3位點(diǎn)夾心免疫測(cè)試法。在檢 測(cè)過(guò)程中，二元標(biāo)記試劑中的抗體與樣品中的肌鈣蛋白I結(jié)合，產(chǎn)生免疫復(fù)合物。免疫復(fù)合 物中所含的生物素隨機(jī)與磁性顆粒上標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合。
[0011] Roche公司提供的cTnl檢測(cè)試劑盒，可將其中的生物素化的抗cTnl的單克隆抗體 和釕（Ru)絡(luò)合物標(biāo)記的抗cTnl單克隆抗體與抗原形成三明治夾心法結(jié)構(gòu)，通過(guò)電化學(xué)發(fā) 光免疫分析法（ECLIA)測(cè)定cTnl。
[0012] 化學(xué)發(fā)光法雖具有準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、精密度好的優(yōu)點(diǎn)，其靈敏度也遠(yuǎn)高于酶聯(lián)免疫 吸附試驗(yàn)法和膠體金免疫層析法。但是，現(xiàn)有的CTnI商業(yè)檢測(cè)試劑盒靈敏度對(duì)于臨床應(yīng)用 依然不夠高，分析靈敏度都在5pg/mL以上，因而不能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)超低濃度的cTnl，故不 能滿足AMI早期診斷的高要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種CTnI檢測(cè)試劑盒及其制備方 法，該試劑盒具有超高靈敏度，可以為AMI的早期診斷提供準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，從而提高AMI 早期診斷的敏感性。
[0014] 本發(fā)明還提供一種CTnI檢測(cè)方法，具有超高靈敏度，為AMI的早期診斷提供了更 為先進(jìn)的方法。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明，提供了一種CTnI檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包括標(biāo)記有示蹤標(biāo)記物的 至少一株第一抗cTnl抗體和包被磁性微球的至少一株第二抗cTnl抗體，并且所述第一抗 cTnl抗體與cTnl的結(jié)合位點(diǎn)相異于第二抗cTnl抗體與cTnl的結(jié)合位點(diǎn)。所述第一抗 cTnl抗體和第二抗cTnl抗體可以是抗cTnl單克隆抗體和/或抗cTnl多克隆抗體。該試 劑盒是超敏檢測(cè)試劑盒，在用于檢測(cè)cTnl時(shí)，具有很高的靈敏度。
[0016] 在本發(fā)明中，所述第一抗CTnI抗體和第二抗CTnI抗體的區(qū)別在于它們與CTnI的 位點(diǎn)結(jié)合不同。因此，在本發(fā)明的等同技術(shù)方案中，試劑盒也可以包括標(biāo)記有示蹤標(biāo)記物的 至少一株第二抗cTnl抗體和包被磁性微球的至少一株第一抗cTnl抗體。就本發(fā)明而言， 超敏是指檢測(cè)靈敏度在5pg/mL以下，尤其是3pg/mL以下。
[0017] 本發(fā)明采用雙抗體夾心法檢測(cè)cTnl，這種方法采用兩株或多株針對(duì)cTnl的單克 隆或多克隆抗體，其中被標(biāo)記的一株或多株抗cTnl的單抗或多抗用于捕獲cTnl氨基酸區(qū) 段，連接在載體上的其他株抗cTnl的單抗或多抗用于結(jié)合cTnl上不同于前者所結(jié)合的氨 基酸區(qū)段。
[0018] 優(yōu)選地，所述第一抗cTnl抗體與cTnl的結(jié)合位點(diǎn)為cTnl的10-100氨基酸區(qū)段； 所述第二抗cTnl抗體與cTnl的結(jié)合位點(diǎn)為cTnl的40-200氨基酸區(qū)段。選擇這些結(jié)合區(qū) 段的cTnl抗體有利于對(duì)其進(jìn)行更好地標(biāo)記或包被磁球，同時(shí)有利于在檢測(cè)過(guò)程中cTnl抗 體與cTnl的結(jié)合，提高檢測(cè)特異性、準(zhǔn)確性。
[0019] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述試劑盒包括兩種第一抗cTnl抗體，與cTnl的結(jié)合位 點(diǎn)分別為cTnl的10-50和60-100氨基酸區(qū)段；所述試劑盒包括兩種第二抗cTnl抗體，與 cTnl的結(jié)合位點(diǎn)分別為cTnl的40-80和120-200氨基酸區(qū)段。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物可以選自本領(lǐng)域中常用于標(biāo)記抗原或抗體的示蹤標(biāo) 記物，例如金剛烷、魯米諾、異魯米諾及其衍生物、吖啶酯、堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶， 尤其優(yōu)選為N- (4-氨丁基）-N-乙基異魯米諾（ABEI)。
[0021] 適用于本發(fā)明的磁性微球也稱為磁珠，可以是本領(lǐng)域中常用的磁性微球。優(yōu)選的 是，本發(fā)明使用的磁性微球，是將納米級(jí)的Fe 2O3或Fe 304磁性粒子和有機(jī)高分子材料進(jìn)行復(fù) 合，形成具有超順磁性和極大量蛋白吸附容量的微米級(jí)的固相微球，具有在外加磁場(chǎng)作用 下可迅速被磁化，在撤走磁場(chǎng)后剩磁為零的屬性。其中，所述有機(jī)高分子材料的種類沒(méi)有特 別限制，可根據(jù)需要進(jìn)行選擇。
[0022] 本發(fā)明所使用的磁性微球應(yīng)能滿足直徑為0. 1_5μπι，磁性微球還可以通過(guò)表面改 性而帶有多種活性功能基團(tuán)，包括但不限于-OH、-C00H、-ΝΗ2。
[0023] 在一個(gè)具體實(shí)施例中，所述磁性微球?yàn)镕e2O3或Fe 304磁性納米粒子與有機(jī)高分子 材料的復(fù)合體，并具有〇. 1-5 μ m的粒徑；并且，所述磁性微球任選地通過(guò)表面改性而帶有 一種或多種活性功能基團(tuán)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，在所述試劑盒中，第一抗cTnl抗體和第二抗cTnl抗體的濃度分別為 1- 20μ g/mL，示蹤標(biāo)記物的濃度為5-500ng/mL，磁性微球的濃度為0. l-2mg/mL。上述各成 分的濃度基于包含該成分的各試劑盒組分的量計(jì)。
[0025] 根據(jù)本發(fā)明，所述示蹤標(biāo)記物直接或間接地標(biāo)記第一抗cTnl抗體。間接標(biāo)記的方 式包括但不限于通過(guò)異硫氰酸熒光素（FITC)與抗FITC抗體體系或通過(guò)鏈霉親和素（SA) 與生物素（Biotin)體系進(jìn)行間接標(biāo)記。直接標(biāo)記是指ABEI直接與第一抗cTnl抗體連接 進(jìn)行標(biāo)記；間接標(biāo)記是指通過(guò)中間媒介鏈接體系使得ABEI標(biāo)記第一抗cTnl抗體，所述中間 媒介鏈接體系包括但不限于FITC與抗FITC抗體體系或鏈霉親和素與生物素體系。本發(fā)明 人發(fā)現(xiàn)，間接標(biāo)記有利于減弱空間效應(yīng)，有利于信號(hào)的放大，使得檢測(cè)更加靈敏。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明，所述第二抗cTnl抗體直接或間接地包