基于核酸適配體和錳卟啉催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體涉及一種基于核酸適配體和錳卟啉催化的化學(xué)發(fā) 光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)（protein)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命，它與各種形式的 生命活動(dòng)緊密聯(lián)系。蛋白質(zhì)的定量及分析檢測(cè)對(duì)基礎(chǔ)研宄及臨床應(yīng)用起著非常重要的作 用?，F(xiàn)階段，在醫(yī)學(xué)診斷以及分析化學(xué)等領(lǐng)域，檢測(cè)蛋白質(zhì)的最普遍的方法還是基于抗原-抗體的特異性作用。由于抗原與抗體間的親和作用較強(qiáng)，檢測(cè)方法具有很高的靈敏度和較 好的特異性。而基于免疫的檢測(cè)方法也有它的缺點(diǎn)：抗體的篩選、鑒定、及分離過(guò)程依賴于 動(dòng)物和細(xì)胞培養(yǎng)，而且檢測(cè)過(guò)程需要進(jìn)行抗體的固定、信號(hào)輸出基團(tuán)的修飾，這無(wú)疑增加了 研宄工作的難度和要求。
[0003] 核酸適配體是通過(guò)指數(shù)腹肌的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX)篩選而獲得的具有特 異性序列的寡聚核苷酸片段，它對(duì)其靶分子具有高度的親和力，并且可以通過(guò)化學(xué)生產(chǎn)獲 得，被譽(yù)為"化學(xué)抗體"。近些年，許多研宄者利用核酸適配體來(lái)替代抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測(cè)。 但目前已見(jiàn)報(bào)道的基于核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法，主要存在著靈敏度低，穩(wěn)定性差， 步驟繁瑣，成本高等缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決現(xiàn)有技術(shù)中基于核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法存在著靈敏度低、 穩(wěn)定性差、步驟繁瑣、成本高等缺點(diǎn)的技術(shù)問(wèn)題，提供一種基于核酸適配體和錳卟啉催化的 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，該方法是基于核酸適配體誘導(dǎo)的錳卟啉集聚建立的快速、靈 敏、特異、簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下：
[0006] 一種基于核酸適配體和錳卟啉催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，包括以下步 驟：
[0007] (1)制備錳卟啉探針；
[0008] (2)蛋白質(zhì)檢測(cè)
[0009] 向化學(xué)反應(yīng)器中加入20禮1'1^8-!1(：1，25 4]\1魯米諾和0.05%1'1^〇11乂-100，再加 入錳卟啉探針，最后加入包含核酸適配體和待測(cè)蛋白質(zhì)的溶液；
[0010] 將所述化學(xué)反應(yīng)器放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中，最后用微量進(jìn)樣器加入濃度為IOOmM 的H2O2，記錄化學(xué)發(fā)光隨時(shí)間的變化。
[0011] 在上述技術(shù)方案中，制備錳卟啉探針的具體步驟如下：
[0012] 在50mL的容量瓶中加入5, 10, 15, 20-四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉lOlmg， MnCl2 · 4H20 16mg，將其溶解于IOmL甲醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流進(jìn)行配位反應(yīng)，配位反 應(yīng)完成后用氯離子交換樹(shù)脂交換24小時(shí)，然后用乙酸乙酯沉淀，過(guò)濾，得到的紫黑色固體 在真空烘箱中烘干，制備得到錳卟啉探針；合成路線如下：
[0013]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于核酸適配體和錳卟啉催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 制備錳卟啉探針； (2) 蛋白質(zhì)檢測(cè) 向化學(xué)反應(yīng)器中加入20mM Tris-HCl，25 μ M魯米諾和0.05% Triton X-100,再加入錳 卟啉探針，最后加入包含核酸適配體和待測(cè)蛋白質(zhì)的溶液； 將所述化學(xué)反應(yīng)器放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中，最后用微量進(jìn)樣器加入濃度為IOOmM的 H2O2，記錄化學(xué)發(fā)光隨時(shí)間的變化。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，制備錳卟啉探針的具體步驟如下： 在501^的容量瓶中加入5，10，15,20-四（1-甲基-4-吡啶基）卟啉10111^，]\111(：1 2.4!120 16mg，將其溶解于IOmL甲醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱回流進(jìn)行配位反應(yīng)，配位反應(yīng)完成后用 氯離子交換樹(shù)脂交換24小時(shí)，然后用乙酸乙酯沉淀，過(guò)濾，得到的紫黑色固體在真空烘箱 中烘干，制備得到錳卟啉探針；合成路線如下：
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸適配體的堿基濃度為12. 5 μ M。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述錳卟啉探針的濃度為5 μ Μ。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體和錳卟啉催化的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)蛋白質(zhì)的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)中基于核酸適配體的蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法存在著靈敏度低，穩(wěn)定性差，步驟繁瑣，成本高等缺點(diǎn)的技術(shù)問(wèn)題。方法，包括以下步驟：(1)制備錳卟啉探針；(2)蛋白質(zhì)檢測(cè)向化學(xué)反應(yīng)器中加入20mM Tris-HCl，25μM魯米諾和0.05％Triton X-100，再加入錳卟啉探針，最后加入包含核酸適配體和待測(cè)蛋白質(zhì)的溶液；將所述化學(xué)反應(yīng)器放入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器中，最后用微量進(jìn)樣器加入濃度為100mM的H2O2，記錄化學(xué)發(fā)光隨時(shí)間的變化。該方法是基于核酸適配體誘導(dǎo)的錳卟啉集聚建立的快速、靈敏、特異、簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法。
【IPC分類】C07D487-22, G01N21-76
【公開(kāi)號(hào)】CN104634775
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510063506
【發(fā)明人】于聰, 李文英, 張青峰, 陳健, 周會(huì)鵬, 李永新
【申請(qǐng)人】中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年2月6日