基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微藻生長(zhǎng)環(huán)境監(jiān)測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微藻是一類(lèi)可以將二氧化碳轉(zhuǎn)化為潛在的生物燃料、食品、飼料和高價(jià)值的生物活性分子并能進(jìn)行光合作用的真核微生物。微藻具有生態(tài)和生物學(xué)價(jià)值，是一種重要的生物質(zhì)資源。
[0003]小球藻是一類(lèi)單細(xì)胞綠藻，屬于綠藻門(mén)、綠藻綱(Chlorophyceae)、綠球藻目、軟囊藻科、小球藻屬，廣泛分布于自然界，淡水水域中種類(lèi)最多。目前全球范圍已知的小球藻有15種左右，并且有多達(dá)百種以上的變種。小球藻細(xì)胞形狀一般為球形或者橢球形，直徑2-12 μπι。已有研宄表明，小球藻含豐富的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、多糖、食用纖維、維生素、微量元素和活性代謝產(chǎn)物。近年來(lái)，我國(guó)已開(kāi)始重視小球藻的開(kāi)發(fā)利用。綜上所述，小球藻具有重要的經(jīng)濟(jì)和科研價(jià)值，具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0004]拉曼光譜是一種散射光譜，是研宄分子振動(dòng)的一種光譜方法，它的原理和機(jī)制與紅外光譜不同，紅外光譜對(duì)極性基團(tuán)有很強(qiáng)的檢出能力，而非極性基團(tuán)如C = c、c-c等則具有很強(qiáng)的拉曼活性。但它們提供的結(jié)構(gòu)信息是類(lèi)似的，都是關(guān)于分子內(nèi)部各種分子振動(dòng)頻率及有關(guān)振動(dòng)能級(jí)的情況，所以能從分子水平上反映樣品化學(xué)組成和分子結(jié)構(gòu)上的差異，實(shí)現(xiàn)分子中某些化學(xué)鍵和官能團(tuán)的“指紋鑒別”。另外水的拉曼散射很微弱幾乎不產(chǎn)生干擾信號(hào)，使得拉曼在研宄水溶液中的活體生物的無(wú)損檢測(cè)上具有其他分子光譜無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法需要對(duì)樣本進(jìn)行染色或復(fù)雜的化學(xué)處理，操作相對(duì)繁瑣、耗時(shí)、耗力的問(wèn)題。通過(guò)對(duì)采集到的拉曼信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理克服了拉曼光譜強(qiáng)度值容易受微藻不同生長(zhǎng)階段、不同曝光時(shí)間以及色素隨時(shí)間推移產(chǎn)生分解等的影響。
[0006]一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，包括以下步驟:
[0007](I)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下不同時(shí)期的拉曼光譜原始信息；
[0008](2)對(duì)步驟(I)中獲得的拉曼光譜原始信息進(jìn)行預(yù)處理得到預(yù)處理譜圖，提取譜圖中多個(gè)微藻特征峰對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值；
[0009](3)以步驟(2)中的拉曼強(qiáng)度值作為輸入，同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同時(shí)期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型；
[0010](4)取待監(jiān)測(cè)活體藻液，通過(guò)步驟⑴和步驟(2)的處理獲得該待監(jiān)測(cè)活體藻液的特征峰處的拉曼強(qiáng)度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測(cè)藻液氮脅迫隨時(shí)間變化的結(jié)果O
[0011]在本發(fā)明中，拉曼光譜儀具體選用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀，在對(duì)樣品進(jìn)行信息采集時(shí)，都是在恒溫(約25°c )條件下進(jìn)行的。
[0012]在步驟(I)中，將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整(避免產(chǎn)生氣泡)，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺(tái)上，利用激光強(qiáng)度為Imv的激光束，并通過(guò)50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時(shí)間ls，得到所述的拉曼光譜原始信息。同時(shí)，考慮到分類(lèi)對(duì)象是活體微藻，由于活體微藻樣本在采集時(shí)容易出現(xiàn)樣本漂移或者是采樣點(diǎn)容易移動(dòng)等問(wèn)題，需對(duì)載玻片上的藻液采用瓊脂進(jìn)行固定。
[0013]在步驟(2)中，所述的預(yù)處理為依次進(jìn)行的平滑處理、基線(xiàn)校正和歸一化處理。
[0014]由于原始拉曼受熒光干擾較大，熒光的產(chǎn)生會(huì)覆蓋拉曼的信號(hào)，因此首先采用平滑和基線(xiàn)校正的方法去除熒光的干擾，凸顯信號(hào)，且平滑和基線(xiàn)校正處理均基于拉曼光譜儀附帶的軟件WIRE3.3。歸一化處理，主要是為了消除微藻不同生長(zhǎng)階段、不同曝光時(shí)間以及色素隨時(shí)間推移產(chǎn)生分解等的影響，采用軟件unscrambler 9.7實(shí)現(xiàn)。
[0015]在所述的步驟(3)中，所述多元回歸算法為偏最小二乘回歸法算法、主成分回歸算法、逐步回歸算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、支持向量機(jī)算法或LDA模型，優(yōu)選的多元回歸算法為L(zhǎng)DA模型。LDA鑒別分析的基本思想是將高維的模式樣本投影到最佳鑒別矢量空間，以達(dá)到抽取分類(lèi)信息和壓縮特征空間維數(shù)的效果，投影后保證模式樣本在新的子空間有最大的類(lèi)間距離和最小的類(lèi)內(nèi)距離，即模式在該空間中有最佳的可分離性。因此，它是一種有效的特征抽取方法。
[0016]本發(fā)明中，所述的活體藻液樣本為蛋白核小球藻。由于該藻種油脂含量較高，容易受環(huán)境氮的影響積累一定的油脂成分，同時(shí)藻的個(gè)體大小適合在顯微拉曼下進(jìn)行觀察。
[0017]在所述的步驟(3)中，所述的微藻特征峰指的是1440011'OOlcnT1和I^OcnT1處的油脂峰。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0019]本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，不需要配制任何溶液以及化學(xué)測(cè)定，大大簡(jiǎn)化了操作步驟，縮短了檢測(cè)時(shí)間，也避免了由于操作人員操作不熟練或者主觀因素帶來(lái)的測(cè)量結(jié)果不準(zhǔn)確等后果。通過(guò)對(duì)拉曼信號(hào)進(jìn)行歸一化處理克服了拉曼光譜強(qiáng)度值容易受微藻不同生長(zhǎng)階段、不同曝光時(shí)間以及色素隨時(shí)間推移產(chǎn)生分解等的影響。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1為蛋白核小球藻樣本在氮脅迫下不同時(shí)期的原始拉曼譜圖。
[0021]圖2為蛋白核小球藻樣本預(yù)處理后在氮脅迫下不同時(shí)期的拉曼譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。
[0023]取氮脅迫下的蛋白核小球藻樣本，采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀(inVia-Reflex 532/XYZ)，獲取活體藻液樣本的拉曼光譜原始信息。即將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整(避免產(chǎn)生氣泡)，并對(duì)藻液采用瓊脂進(jìn)行固定，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺(tái)上。其中曝光時(shí)間設(shè)置為ls，激光強(qiáng)度為lmv，累計(jì)次數(shù)一次。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程都是在恒溫(約25°C )條件下進(jìn)行的。采用上述的方法分別采集氮脅迫下(I天，4天，7天)蛋白核小球藻樣本的原始拉曼譜線(xiàn)，如圖1所示。
[0024]由于原始拉曼光譜圖受熒光干擾較大，熒光的產(chǎn)生會(huì)覆蓋拉曼的信號(hào)，因此首先采用平滑和基線(xiàn)校正的方法去除熒光的干擾，凸顯信號(hào)。這兩種預(yù)處理的過(guò)程都是在軟件WIRE3.3中實(shí)現(xiàn)的，然后采用歸一化處理以克服拉曼光譜強(qiáng)度值容易受微藻不同生長(zhǎng)階段、不同曝光時(shí)間以及色素隨時(shí)間推移產(chǎn)生分解等的影響，通過(guò)軟件unscrambler 9.7實(shí)現(xiàn)。圖2為蛋白核小球藻樣本經(jīng)預(yù)處理以后的拉曼譜圖。
[0025]線(xiàn)性判別分析(LDA)是一種監(jiān)督子空間學(xué)習(xí)技術(shù)，是特征提取和分類(lèi)的傳統(tǒng)統(tǒng)計(jì)工具，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于計(jì)算機(jī)視覺(jué)，模式識(shí)別和機(jī)器學(xué)習(xí)。LDA尋求一種線(xiàn)性變換，使得在變換后類(lèi)間和類(lèi)內(nèi)協(xié)方差最大化，并通過(guò)最大化類(lèi)間距離和最小化類(lèi)內(nèi)找到判別變換(矩陣)距離。本專(zhuān)利采集氮脅迫下不同時(shí)期蛋白核小球藻的拉曼光譜，通過(guò)提取油脂特征峰對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值作為輸入，結(jié)合LDA建立氮脅迫隨時(shí)間變化的判別模型。
[0026]對(duì)60個(gè)藻液樣本進(jìn)行上述預(yù)處理，然后采用LDA建立不同時(shí)期的判別模型，其中將氮脅迫后第I天，第4天和第7天分別標(biāo)定為和“3”。隨機(jī)選取上述不同時(shí)期各45個(gè)樣本用于建模，15個(gè)樣本用于預(yù)測(cè)。對(duì)預(yù)處理后的拉曼光譜提取其在1440CHT1、1301CHT1和1270CHT1處的油脂峰對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值，將它們作為輸入變量，需要判定的生長(zhǎng)時(shí)期作為輸出，得到模型的判別率為100 %。
[0027]不同時(shí)期各5個(gè)預(yù)測(cè)樣本，針對(duì)每個(gè)預(yù)測(cè)樣本，采用雷尼紹顯微共焦拉曼光譜儀獲取各個(gè)樣本的拉曼光譜原始信息，并對(duì)拉曼光譜原始信息依次進(jìn)行平滑處理、基線(xiàn)校正和歸一化處理，得到對(duì)應(yīng)的預(yù)處理譜圖，然后提取144001^1301(^1和1270cm ―1油脂峰處的拉曼強(qiáng)度值，將其輸入LDA模型，獲得預(yù)測(cè)樣本的精度為100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下不同時(shí)期的拉曼光譜原始信息； (2)對(duì)步驟(I)中獲得的拉曼光譜原始信息進(jìn)行預(yù)處理得到預(yù)處理譜圖，提取譜圖中多個(gè)微藻特征峰對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值； (3)以步驟(2)中的拉曼強(qiáng)度值作為輸入，同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同時(shí)期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型； (4)取待監(jiān)測(cè)活體藻液，通過(guò)步驟(I)和步驟(2)的處理獲得該待監(jiān)測(cè)活體藻液的特征峰處的拉曼強(qiáng)度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測(cè)藻液氮脅迫隨時(shí)間變化的結(jié)果。
2.如權(quán)利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，在步驟(I)中，將制好的藻液滴于載玻片上，用蓋玻片壓平整，然后固定在顯微拉曼光譜儀物鏡下方載物臺(tái)上，利用激光強(qiáng)度為Imv的激光束，并通過(guò)50X的物鏡聚焦到樣本的表面，曝光時(shí)間ls，得到所述的拉曼光譜原始信息。
3.如權(quán)利要求2所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，對(duì)載玻片上的藻液采用瓊脂進(jìn)行固定。
4.如權(quán)利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的預(yù)處理為依次進(jìn)行的平滑處理、基線(xiàn)校正和歸一化處理。
5.如權(quán)利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述多元回歸算法為偏最小二乘回歸法算法、主成分回歸算法、逐步回歸算法、人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法、支持向量機(jī)算法或LDA模型。
6.如權(quán)利要求5所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，所述的多元回歸算法采用LDA模型。
7.如權(quán)利要求1所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，所述的活體藻液樣本為蛋白核小球藻。
8.如權(quán)利要求7所述的基于微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述的微藻特征峰指的是1440011'OOlcnT1和1270cm ―1處的油脂峰。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種微藻油脂特征峰的氮脅迫隨時(shí)間變化的監(jiān)測(cè)方法，步驟包括：(1)采用拉曼光譜儀，獲取蛋白核小球藻樣本在同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境下不同時(shí)期的拉曼光譜原始信息；(2)對(duì)獲得的拉曼光譜原始信息進(jìn)行預(yù)處理得到預(yù)處理譜圖，提取譜圖中多個(gè)微藻特征峰對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值；(3)以拉曼強(qiáng)度值作為輸入，同一氮營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的不同時(shí)期作為輸出，建立基于多元回歸算法的判別模型；(4)取待監(jiān)測(cè)活體藻液，通過(guò)步驟(1)和步驟(2)的處理獲得對(duì)應(yīng)的拉曼強(qiáng)度值并輸入所述的判別模型，獲得待監(jiān)測(cè)藻液氮脅迫隨時(shí)間變化的結(jié)果。本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法需要對(duì)樣本進(jìn)行染色或復(fù)雜的化學(xué)處理，操作相對(duì)繁瑣、耗時(shí)、耗力的問(wèn)題。
【IPC分類(lèi)】G01N21-65
【公開(kāi)號(hào)】CN104634771
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510043140
【發(fā)明人】邵詠妮, 蔣林軍, 潘健, 何勇
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年5月20日
【申請(qǐng)日】2015年1月28日