高爾基體蛋白gp73乳膠增強免疫比濁檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)學(xué)免疫體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，設(shè)及高爾基體蛋白gp73乳膠 增強免疫比濁檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 高爾基體蛋白甜73(甜73, Golml，Gol地2)是表觀分子量73kD的高爾基體蛋白 質(zhì)。化rin蛋白酶能夠識別gp73,切掉N端55個氨基酸（包含胞質(zhì)區(qū)域、跨膜區(qū)和高爾基 體內(nèi)coiled-coil domain 10個氨基酸），該使Golph2能夠分泌到血液中（Traffic 2007; 8:1415-1423.)〇
[0003] 急性和慢性肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中的甜73含量較健康人顯著增加。甜73 對原發(fā)性肝癌的早期診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率分別達(dá)到72%、95%和86. 2% (中國 腫瘤臨床，2013 ;v40, Issue (1) ;29-31)，靈敏度、特異性和準(zhǔn)確率皆高于常規(guī)腫瘤標(biāo)志物 AFP和CA199。gp73聯(lián)合AFP和CA199可W大大提高肝癌早期診斷的臨床意義。
[0004] 血清中g(shù)p73的含量還和肝硬化程度、肝纖維化程度、肝功能轉(zhuǎn)氨酶、己肝病毒載 量存在一定程度上的正相關(guān)。所W gp73除了可W作為原發(fā)性肝癌的早期診斷指標(biāo)，還可W 輔助檢測肝硬化和肝纖維化等疾病。
[0005] 除了和肝癌密切相關(guān)外，gp73在腎癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌等癌癥組織 和癌芳組織中都有局表達(dá)。甜73是潛在的上述癌癥尤其是前列腺癌的診斷指標(biāo)。
[0006] 體液標(biāo)志蛋白的檢測方法主要采用免疫學(xué)方法，W酶聯(lián)免疫吸附測定 (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、方義身才免疫測定（Radioimmunoassay，RIA) 和膠體金層析法（俗稱"金標(biāo)"）該幾種方法為主。ELISA方法雖然在臨床上使用了近二十 年，但它依然存在一些致命缺點，定量準(zhǔn)確性差、操作時間長、自動化程度低，一般只能用于 定性檢測。RIA靈敏度高，但不穩(wěn)定，重復(fù)性比化ISA差，而且存在放射性污染的危險。金標(biāo) 方法雖然穩(wěn)定性較好，但靈敏度較低，只能定性，不能定量。特別是重復(fù)性差該一缺點限制 了該些檢測技術(shù)在臨床上的應(yīng)用，尤其不適合用于需要通過準(zhǔn)確定量來幫助對疾病進(jìn)行診 斷的體液標(biāo)志蛋白的定量檢測。因此，尋找更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確的血漿蛋白定量檢測方法一直是 國際上近十年來的研究熱點。
[0007] 膠乳顆粒增強比濁法（particle-enhanced 1:urbidimet;ric immunoassay,陽TIA) 是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法。PETIA法大體分 為兩種，一種是散射比濁檢測法，另一種是透射比濁檢測法。該兩種方法的基本原理非常相 似，都是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)單克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在 短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性能 或透光性能（即吸光度）的改變與被測抗原的濃度有較強的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可W反 映被測抗原的濃度。PETIA檢測方法是在均相反應(yīng)體系中進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)及結(jié)果的測 定。抗原、抗體反應(yīng)后，直接測定反應(yīng)液的吸光度值，省卻了 ELISA法反復(fù)解育和洗板等煩 瑣操作步驟，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。
[000引 目前，PETIA檢測試劑所采用的乳膠顆粒多為惰性微球、駿基化微球及氨基化微 球。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過其表面的駿基或氨基與抗體的氨基端共價結(jié) 合，在微球與抗體之間有一個橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而 且還為抗體提供合適的=維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。
[0009] 目前還未見利用PETIA法檢測人體血清中高爾基體蛋白甜73的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球。
[0011] 本發(fā)明的再一的目的是，提供所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的用途。
[0012] 本發(fā)明的另一的目的是，提供所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的制備方法。
[0013] 本發(fā)明的第四個目的是，提供一種甜73蛋白乳膠增強免疫比濁檢測試劑盒。
[0014] 為實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0015] 一種偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球，所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球為駿基聚 苯己締乳膠微球，粒徑為90-1 lOnm。
[0016] 優(yōu)選地，所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的制備方法為：
[0017] a)用DCC催化N-哲基班巧酷亞胺和駿基聚苯己締乳膠微球上的駿 基反應(yīng)，所用的駿基聚苯己締乳膠微球、N-哲基班巧酷亞胺、DCC的質(zhì)量比為 (0.09-0. 12) : (25-35) : (55-65)，24-26°C反應(yīng)8-12min，然后離屯、去上清，得到活化的駿 基聚苯己締乳膠微球；
[001引 b)取甜73抗體溶液，預(yù)冷至4°CW下，然后加入到步驟a)制備的活化的駿基聚 苯己締乳膠微球中，所述的gp73抗體溶液中含有的gp73抗體與所述的駿基聚苯己締乳 膠微球的質(zhì)量比為；(0.9-1. 05) : (0.09-0. 12) ,110-130 瓦超聲 4-6min，3-5 °C 下反應(yīng) 25-35min。
[0019] 更優(yōu)選地，所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的制備方法為：
[0020] a)用DCC催化N-哲基班巧酷亞胺和駿基聚苯己締乳膠微球上的駿基反應(yīng)，所用 的駿基聚苯己締乳膠微球、N-哲基班巧酷亞胺、DCC的質(zhì)量比為0.1 : 30 : 60, 25°C反應(yīng) lOmin，然后離屯、去上清，得到活化的駿基聚苯己締乳膠微球；
[0021] b)取gp73抗體溶液，預(yù)冷至4°CW下，然后加入到步驟a)制備的活化的駿基聚苯 己締乳膠微球中，所述的gp73抗體溶液中含有的gp73抗體與所述的駿基聚苯己締乳膠微 球的質(zhì)量比為；1 : 0. 1，120瓦超聲5min，4°C下反應(yīng)30min。
[0022] 優(yōu)選地，所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的粒徑為lOOnm。
[0023] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0024] 如上任一所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球在制備檢測樣本中g(shù)p73蛋白含量的 試劑中的應(yīng)用。
[0025] 所述的樣本為血清、血漿、全血、組織裂解液或細(xì)胞裂解液。
[0026] 為實現(xiàn)上述第=個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0027] 如上所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的制備方法，包括W下步驟：
[0028] a)用DCC催化N-哲基班巧酷亞胺和駿基聚苯己締乳膠微球上的駿 基反應(yīng)，所用的駿基聚苯己締乳膠微球、N-哲基班巧酷亞胺、DCC的質(zhì)量比為 (0.09-0. 12) : (25-35) : (55-65)，24-26°C反應(yīng)8-12min，然后離屯、去上清，得到活化的駿 基聚苯己締乳膠微球；
[0029] b)取甜73抗體溶液，預(yù)冷至4°CW下，然后加入到步驟a)制備的活化的駿基聚 苯己締乳膠微球中，所述的gp73抗體溶液中含有的gp73抗體與所述的駿基聚苯己締乳 膠微球的質(zhì)量比為；(0.9-1. 05) : (0.09-0. 12) ,110-130 瓦超聲 4-6min，3-5 °C 下反應(yīng) 25-35min。
[0030] 為實現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：
[0031] 一種gp73蛋白乳膠增強免疫比濁檢測試劑盒，所述的試劑盒包含如上任一所述 的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球。
[0032] 優(yōu)選地，所述的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球在試劑盒中W溶液形式存在，所述 的溶液中偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的固含量為0. 1% -0. 3%，且所述的溶液中還含有 2001111化(：1、5%體積濃度的甘油、0.05%體積濃度的？1'〇(：1111 300、0.6%體積濃度的65八 和5%體積濃度的陽66000。
[0033] 優(yōu)選地，所述的試劑盒還包含含有防腐劑、穩(wěn)定劑的緩沖液，W及gp73蛋白標(biāo)準(zhǔn) 品。
[0034] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0035] 1、靈敏度高，檢測限低至2511肖/111以且仍處在較好的線性范圍內(nèi)；
[0036] 2、準(zhǔn)確度和精密度高，線性范圍達(dá)到實際應(yīng)用的要求；
[0037] 3、穩(wěn)定性高，實驗重復(fù)性好；
[003引 4、可W應(yīng)用于全自動生化儀，使用簡單方便。
[0039] 由此可見，本發(fā)明的gp73乳膠增強免疫比濁檢測試劑盒具有非常大的臨床實用 價值，可應(yīng)用于急性、慢性肝炎診斷，肝癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、乳腺癌等癌癥輔助診 斷，還可應(yīng)用于肝癌、前列腺癌等術(shù)后評價或者肝移植、腎移植等器官移植術(shù)后病人身體狀 況監(jiān)測。
【附圖說明】
[0040] 附圖1是甜73標(biāo)準(zhǔn)品中甜73含量的數(shù)據(jù)擬合曲線。
[0041] 附圖2是26例人群樣本的血清甜73含量檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0042] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0043] 實施例1本發(fā)明的偶聯(lián)有g(shù)p73抗體的乳膠微球的制備（一）
[0044] 1、試劑制備及標(biāo)準(zhǔn)
[0045] 重組蛋白甜73制備；為采用無血清培養(yǎng)基，由CHO細(xì)胞分泌表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白 gp73(氨基酸序列為如SEQ ID NO. 1所示）經(jīng)過鑲親和層析和離子交換層析，目的蛋白在 SDS-PAGE膠上為單一條帶，純度98% W上。
[0046] 甜73抗體