一種快速定量檢測心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的均相熒光免疫試劑組及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體設(shè)及一種快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的 均相巧光免疫試劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性屯、肌梗死（AMI)的發(fā)病率及死亡率均很高，現(xiàn)代治療學(xué)認(rèn)為，AMI發(fā)病后能迅 速得到確診并進(jìn)行再灌注治療，對于降低死亡率及改善預(yù)后十分重要。WK)推薦的Affl的診 斷條件為：臨床癥狀、屯、電圖異常和生化指標(biāo)等。但大約1/3的Affl病人早期臨床癥狀不典 型，約50%的病人屯、電圖不能出現(xiàn)特征性ST段改變，所W在此期的診斷來說一個靈敏又有 特異性的屯、肌指標(biāo)尤為重要。
[000引 屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（Heart fatty acid binding protein, H-FAB巧是一族 分子量為14-16kD的胞內(nèi)蛋白質(zhì)，至少有肝、小腸、屯、、腦、腎、骨骼肌、脂肪組織、回腸、表皮 9種類型，各型之間具有不同的免疫學(xué)差別。H-FABP是存在于屯、肌細(xì)胞胞漿內(nèi)的可溶性蛋 白質(zhì)，分子量15kD，占屯、肌內(nèi)蛋白含量的（4 + 8)%，由132個氨基酸構(gòu)成，呈酸性（pI5)，參 與細(xì)胞脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。屯、肌胞漿與血液中的比值為200000:1。在骨骼肌的濃 度不到屯、肌里的十分之一，在遠(yuǎn)端腎小管、腦組織的特殊部位、乳腺、胎盤內(nèi)含量更低。而肌 紅蛋白在骨骼肌的濃度是屯、肌里的兩倍。正常條件下血流中幾乎檢測不到H-FABP，極微量 的H-FABP可能與破壞的骨骼肌持續(xù)釋放H-FABP有關(guān)，在屯、肌細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜完整性受 到破壞，H-FABP透過受損細(xì)胞膜進(jìn)入外周血循環(huán)，使其血中H-FABP含量升高，1.化開始升 高、化達(dá)到高峰、2化降至正常。該一特性使得H-FABP成為檢測屯、肌損傷早期生化標(biāo)志物。 因與其它FABP在免疫學(xué)上具有特異性，不會發(fā)生交叉反應(yīng)，故對屯、肌損傷的診斷特異性較 強(qiáng)。另外，H-FABP通過腎臟代謝，W原形排出，所W腎功能不全時血里H-FABP的濃度會升 局。
[0004] 目前研究已證實H-FABP對微小屯、肌損傷敏感，檢測血漿H-FABP水平可作為反映 屯、肌不可逆損傷的生化標(biāo)志物，與屯、肌損害的程度成正相關(guān)，此將為臨床法醫(yī)學(xué)對微小屯、 肌損傷及外傷性屯、肌梗死的判定及預(yù)后屯、功能的診斷提供一靈敏性客觀指標(biāo)，在臨床法醫(yī) 檢案中有重要的應(yīng)用價值。
[0005] 國外較常應(yīng)用的有Rapicheck和CardioDetect兩種定性檢測試劑盒，10-15min內(nèi) 得到結(jié)果。Latera^f low是一種準(zhǔn)確度更高的定量檢測方法，2003年用于臨床，15min得到 結(jié)果。W上檢驗方法簡易快捷，節(jié)約時間和費用，不需要特殊檢測設(shè)備，值得臨床推廣。夾 屯、酶免法應(yīng)用兩個來源不同的抗人H-FABP的抗體，分別做固相和液相結(jié)合抗體，臨床常用 有一步法和兩步法。優(yōu)點為檢測結(jié)果準(zhǔn)確，與骨骼肌蛋白、肌紅蛋白、肌漿球蛋白、肌巧蛋白 無交叉反應(yīng)、不需大型儀器，費用合理，缺點是用時較長，需時45-90min，不利于超早期AMI 的診斷及進(jìn)一步處理。
[0006] 均相巧光分析法化omogeneous fluoroimmunoassay，HFIA)是在時間分辨巧光免 疫分析（time-resolued fluoroimmunoassay，TRFIA)技術(shù)的基礎(chǔ)上形成的一種新的巧光免 疫分析技術(shù)。TRFIA技術(shù)采用的巧光物質(zhì)與傳統(tǒng)的巧光染料完全不同，采用的是銅系元素 館巧U)、得（Tb)等作為巧光材料，靈敏度非常高，穩(wěn)定性好，低溫條件可保存=年，因而成 為二十一世紀(jì)最熱口的免疫分析技術(shù)。
[0007] 均相巧光免疫檢測法是用同一抗原的兩個抗體分別標(biāo)記化和巧光染料 Alexa647?；瘶?biāo)記抗體在游離狀態(tài)時，受到340nm光線激發(fā)，只發(fā)射平均波長為615nm 巧光，而在抗原、抗體復(fù)合物形成時，發(fā)生能量傳遞，激發(fā)巧光染料Alexa647發(fā)射出665nm 巧光。標(biāo)記抗體直接與待測樣品進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)，如果能形成抗原、抗體復(fù)合物，則在 665nm出可測得巧光信號。該種方法省卻了酶聯(lián)免疫法反復(fù)解育和洗板等煩瑣操作步驟，幾 分鐘就能獲得結(jié)果，省時省力。并且，此法也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境 等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實地反映被測物質(zhì)的含量。此外，Eu 3+和 Alexa647該對巧光物質(zhì)的最大發(fā)射光波長之間相差較大，未發(fā)生抗原抗體反應(yīng)的本底巧光 值就非常低。而人血清中非特異性物質(zhì)產(chǎn)生的300?500nm巧光，不能激發(fā)Alexa647發(fā)射 巧光信號650nm激發(fā)光。因此非特異性巧光非常低。
[000引本發(fā)明采用均相巧光免疫快速檢測技術(shù)，利用巧光的高靈敏特點，同樣也避免了 膠體金或者巧光H-FABP干式免疫試紙中的硝酸纖維素膜本身孔隙不均一特性對檢測準(zhǔn)確 度和重復(fù)性的不良影響。由于均相巧光免疫檢測中樣品與巧光標(biāo)記抗體全過程都在液相中 全面接觸，反應(yīng)充分，因此可大幅度提高檢測靈敏度和線性范圍，同時反應(yīng)在液相進(jìn)行也增 加了樣品的稀釋倍數(shù)，消除了樣品的基質(zhì)效應(yīng)影響，使定量結(jié)果有很好的可重復(fù)性，提高了 定量結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，可滿足臨床診斷大規(guī)模檢測的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有H-FABP檢測技術(shù)的不足，提供一種快速定量檢測 H-FABP的均相巧光免疫試劑組。本發(fā)明根據(jù)巧光免疫技術(shù)特點和H-FABP抗原抗體系統(tǒng)特 點，設(shè)計新的原材料，試劑和工藝流程，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑組檢測H-FABP水平，具有簡 單，快速，靈敏和特異性好等特點，可同時定量檢測高值和低值樣品，并且性價比高，適用于 臨床快速檢測。
[0010] 本發(fā)明的第一個方面是提供一種快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的均 相巧光免疫試劑組，包括稀±元素馨合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體 (anti-FABP)、近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體和系列濃度 的屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品。
[0011] 優(yōu)選地，稀上元素馨合物為化馨合物。
[001引更優(yōu)選地，稀±元素馨合物為BHHCT-化或1，2-二（1"，1"，1"，2"，2"，3"，3"-走 氣-4"，6"-己二酬-6"-基-對節(jié)基）-4-氯橫酷基苯與館（III)的配合物炬HHBCB-Eu3+)。
[0013] 優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物為Alexa系列近紅外巧光化合物、DyLi曲t系列近 紅外巧光化合物和CF系列近紅外巧光化合物中的至少一種。
[0014] 更優(yōu)選地，所述近紅外巧光化合物Alexa647、DyLi曲t-DY647和CF647中的至少一 種。
[0015] 優(yōu)選地，所述系列濃度的屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品由校準(zhǔn)品稀釋液稀釋屯、臟 型脂肪酸結(jié)合蛋白配制而成，所述校準(zhǔn)品稀釋液為含0. 01-0. 5wt%陽G800、l-5wt% BSA、 5-20wt%甘油、0. 01-0. 05wt%表面活性劑的MOPS緩沖液。
[0016] 屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品可用塑料瓶密封包裝。
[0017] 本發(fā)明的第二個方面是提供本發(fā)明第一個方面所述的均相巧光免疫試劑組的制 備方法，包括W下步驟：
[0018] 1)稀±元素馨合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備：
[0019] 取0. 5-5mg/ml的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體溶液，加入0. 05-0. 5mol/ L的Na肥〇3溶液后，調(diào)抑至8. 5-10,滴加10-100 y g/ml配體化合物溶液，攬拌反應(yīng) 0.6-2h，分離得到配體化合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體，加入終濃度為 0. 05-0. 5wt %的BSA和0. 01-lwt %的NaNs，調(diào)抑至5. 5-6. 5,免疫分析前，加入化溶液， 使配體化合物與化等摩爾濃度，即得，其中，抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體溶液、 NaHC〇3溶液和配體化合物溶液的體積比為0.1-1 : 1 : 0.01-0.05;
[0020] 2)近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體的制備：
[0021] 將抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體用0. 05-0. 5mol/L的NaHC〇3溶液稀釋至 0. 5-5mg/ml，加入近紅外巧光化合物溶解液，攬勻，室溫解育0. 5-化，分離得到近紅外巧光 化合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體；
[0022] 3)系列濃度的屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品的制備：
[0023] 將屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白用校準(zhǔn)品稀釋液稀釋配制成系列濃度，即得，
[0024] 其中，1)、2)和3)的順序可W任意顛倒。
[0025] 其中，稀±元素馨合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體用于免疫分析 時，用標(biāo)記物稀釋液稀釋使用，2-8°C分裝保存。
[0026] 其中，近紅外巧光化合物標(biāo)記的抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體用磯酸鹽緩 沖液稀釋，2-6 °C保存。
[0027] 其中，屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白校準(zhǔn)品2-6°C保存。
[002引優(yōu)選地，抗屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白單克隆抗體在于配體化合物反應(yīng)之前，先進(jìn)行 透析處理。
[0029] 優(yōu)選地，步驟1)中配體化合物為BHHCT或BHHBCB。
[0030] 優(yōu)選地，步驟1)中分離得到配體化合物標(biāo)記的anti-FABP通過離屯、和柱層析方式 進(jìn)行。柱層析采用Se地adexG-SO柱，0. 01-0. Imol/L畑4肥〇3(p服.0)洗脫。
[0031] 優(yōu)選地，步驟2)中，分離得到近紅外巧光化合物標(biāo)記的anti-FABP通過柱層析的 方式進(jìn)行。
[0032] 進(jìn)一步優(yōu)選地，步驟2)中，柱層析采用G25凝膠柱。
[003引優(yōu)選地，步驟2)中，室溫解育時，每隔10-20min混勻一次。
[0034] 本發(fā)明的均相巧光免疫試劑的使用；先將稀±元素馨合物標(biāo)記的anti-FABP溶液 加入反應(yīng)微孔中，再加入近紅外巧光化合物標(biāo)記的anti-FABP溶液，最后分別加入H-FABP 校準(zhǔn)品和臨床檢測樣品，37°C反應(yīng)20分鐘后，用均相巧光免疫分析儀檢測判讀結(jié)果。
[0035] 本發(fā)明提供的快速定量檢測屯、臟型脂肪酸結(jié)合蛋白的均相巧光免疫試劑組，其反 應(yīng)原理為雙抗體夾屯、法的均相巧光免疫法。待測樣品與適當(dāng)比例的稀±元素（例如化 3+) 和巧光標(biāo)記抗體在液相均質(zhì)介質(zhì)中充分混和均勻，在此過程中樣品中的H-FABP既能專一 性地與稀±元素標(biāo)記的抗H-FABP抗體充分結(jié)合，也能與巧光標(biāo)記的H-FABP抗體充分反應(yīng)， 形成"稀±元素-anti-FABP-FABP-anti-FABP-巧光化合物"免疫復(fù)合物，巧光強(qiáng)度可用 專