專利名稱：肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(l-fabp)作為豬肉質(zhì)性狀的分子標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及豬肉質(zhì)性狀候選基因在標(biāo)記輔助選擇中 的應(yīng)用，具體地說是一種肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)基因作為分子標(biāo)記及在豬肉質(zhì) 性狀中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1972 年美國加利福尼亞大學(xué)的 Ocker 等[Ockner，R. K.，J. A. Manning, R. B.Poppenhanusen, and W.K. Ho. A binding protein for fatty acids in cvtosol of intestinal mucosa, liver, myocardium and other tissue. Science, 1972,177 :56_58.] 在大鼠的小腸黏膜發(fā)現(xiàn)了脂肪酸結(jié)合蛋白(Fatty Acid-Binding Proteins，F(xiàn)ABPs)，它廣 泛存在于哺乳動物的小腸、肝、心、腦和骨骼肌的多種細(xì)胞內(nèi)，并且含量豐富，占細(xì)胞內(nèi)可溶 性蛋白總量的3% -8%。FABPs —般含有126-137個氨基酸，同時表現(xiàn)出38% -70%氨基酸 序列的同源性。2002 年Hanhoff 等[Hanhoff T, Lucke C, Spener F. Insights into binding of fatty acids by fatty acid binding proteins. Mol. Cell Biochem,2002,239(1-2) 45-54]研究發(fā)現(xiàn)FABPs有九種組織特異性的類型，分別是肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(Liver FABP，L-FABP)、腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Intestinal FAB P，I-FABP)、心臟型脂肪酸結(jié)合蛋白 (Heart FABP, H-FABP)、脂肪細(xì)胞型脂肪酸結(jié)合蛋白(Adipocyte FABP, A-FABP)、表皮型脂 肪酸結(jié)合蛋白(Epidermal FABP，E_FABP)、回腸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Ileal FABP，I1-FABP)、 腦型脂肪酸結(jié)合蛋白(Brain FABP, B-FABP)、髓磷脂型脂肪酸結(jié)合蛋白(Myelin FABP, M-FABP)和睪丸型脂肪酸結(jié)合蛋白(Testis FABP，T-FABP)。L-FABP在哺乳動物的肝臟和小腸組織中表達，在人的腎臟中也有少量表達，Hera 等(2003)[Hera GM,Chinaga CC,Cheb WY,Wu JL. In vivo studies of liver-type fatty acid binding protein (L-FABP) gene expression in liver of transgenic zerbrafish. Elsevier Science BV2003 ；13 125-133]和 Gertow 等(2004) [Gertow K, Bellanda Μ, Eriksson P, et al. Genetic and structural evaluation of fatty acid transport protein-4in relation to markers of the insulin resistance syndrome. J Clin Endocrinol Metab，2004，89 392-399]研究發(fā)現(xiàn)L-FABP為長鏈脂肪酸和極長鏈脂肪酸攝 取和轉(zhuǎn)運所必須。2003 年 Newbeny 等[Newbeny EP, Xie Y, Kennedy S, et al. Decreased hepatic triglyceride accumulation and altered fatty acid uptake in mice with deletion of the liver fatty acid binding protein. J Biol Chem 2003,278: 51664-51672.]發(fā)現(xiàn)L-FABP基因敲除的大鼠，其脂肪酸轉(zhuǎn)運明顯降低。# M [JIANG Yan-Zhi, LI Xue-ffei, YANG Guang-Xi. Sequence Characterization, Tissue-specific Expression and Polymorphism of the Porcine(Sus scrofa)Liver-type Fatty Acid Binding Protein Gene. Acta Genetica Sinica. 2006,33(7) 598-606]等利用cDNA末端快速擴增(RACE)和PCR技術(shù)，克隆到豬肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(L-FABP)的全長cDNA序列518bp (GenBank登錄號AY960623) 和部分基因組序列(GehBank登錄號DQ182323)。豬L-FABP基因與其他FABPs基因一樣， 由4個外顯子(67bp、173bp、93bp和51bp)和3個內(nèi)含子組成，內(nèi)含子1和3的大小是1679 飾和565bP，沒有獲得內(nèi)含子2的序列，外顯子和內(nèi)含子剪接處符合GT/AG規(guī)律。分析還發(fā) 現(xiàn)，所克隆得到的編碼區(qū)核苷酸序列與已知豬L-FABP基因的編碼區(qū)核苷酸序列存在一定 的變異，分別是外顯子2中T — C (116位)、C — T (231位)、C — A (236位)和A — C (258 位)，演繹成氨基酸在Leu74Met存在差異。為進一步證實這些突變位點在豬群中真實存在， 利用PCR-SSCP檢測方法對4個豬種(藏豬、大河豬、雅南豬和約克夏)的157頭個體的外 顯子2全序列進行SNP位點多態(tài)性片段的基因型分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個C — T的單核苷酸多 態(tài)性，等位基因頻率在中國地方豬種(藏豬、大河豬、雅南豬)與國外約克夏豬種間存在極 顯著的差異。連鎖分析發(fā)現(xiàn)，基因型CC的肌內(nèi)脂肪含量(4. 86士0.22%)顯著的高于基因 型CT(4. 16士0.22% )和ΤΤ(4·05士0.27% )的肌內(nèi)脂肪含量。因此，推測L-FABP基因可 能是影響豬肌內(nèi)脂肪含量的主效基因或與主效基因緊密連鎖的標(biāo)記基因，并且能夠在分子 標(biāo)記輔助選擇中用于對豬肌內(nèi)脂肪含量的遺傳改良。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白(L-FABP)基因作為豬肉質(zhì)性狀 的分子標(biāo)記。本發(fā)明在于獲得與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的L-FABP基因部分片段，并對該片段進行 多態(tài)性分析，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記。本發(fā)明的另一個目的是提供鑒定作為豬分子標(biāo)記的L-FABP基因的PCR-SSCP檢測方法。本發(fā)明的第三個目的是提供所涉及的分子標(biāo)記在豬肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析上的應(yīng)用。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)。一種克隆得到的豬肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(L-FABP)片段，它的核苷酸序列 如表1 表1豬肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白基因(L-FABP)克隆片段 CCCCTCAGCCTCCAATGCCTTTCA ■ CAGGTCTGCCCGACGAACACATCCAGAAGGGGAAGGACATC AAGGGGACATCGGAAATCGTGCAGAATGGGAAGCACTTCAAGTTGACCATCACTACCGGGTCCAAGGTCGTCCAGAA TGAGTTCACCTTGGGAGAGGAGTGTGAGATGGAGACCCTGACTGGGGAGAAGGTCAAG其中，_為此序列片段中突變位點的兩種單核苷酸，該序列中只存在T或C的一 種。所獲得的L-FABP基因片段的核苷酸序列長度為201bp，是內(nèi)含子1和外顯子2的 一部分。序列表1的第25位堿基處存在有一個堿基突變，導(dǎo)致單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism)的產(chǎn)生。將此突變位點作為一個分子標(biāo)記， 通過PCR-SSCP的方法檢測此突變位點，并將檢測結(jié)果與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)，為豬的選種選 育提供實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。本發(fā)明的分子標(biāo)記鑒定方法和性狀關(guān)聯(lián)分析過程如圖11所示。本發(fā)明的分子標(biāo)記鑒定方法，通過下述步驟實現(xiàn)
一、豬L-FABP基因目的片段的獲得1.采集豬血液活體或肉質(zhì)測定時進行血液采集。為在后續(xù)實驗中便于從血液中提取基因組DNA， 應(yīng)使用EDTA抗凝血法進行處理，而不使用肝素抗凝血法。2.從豬血液中提取基因組DNA及電泳檢測 將采集的血液經(jīng)EDTA抗凝血法處理后，使用AXYGEN公司的AxyPr印TM Multisourse Genomic DNAMiniprep Kit試劑盒提取基因組DNA。具體操作步驟如下將 豬冰凍血樣室溫融化，用手術(shù)剪將其剪碎；加入350 μ 1 Buffer PBS和0. 9 μ IRNaseA ；收 集350 μ 1剪碎的血樣組織并轉(zhuǎn)入2ml離心管；如體積不足350 μ 1，補充PBS至350 μ 1 ；加 Λ 150 μ IBuffer C-L和20 μ 1 Proteinase K，立即漩渦震蕩Imin混合均勻，短暫離心后， 將離心管置56°C水浴IOmin ；加入350 μ 1 Buffer P_D，漩渦震蕩30s混合均勻，12000 Xg 離心IOmin ；將DNA制備管置于2ml離心管中，然后把混合液移至制備管中，12000X g離心 Imin ；棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入500 μ 1 Buffer Wl，12000Xg離 心Imin ；棄濾液，將制備管置回到原來的2ml離心管中，加入700 μ 1 Buffer W2,12000 Xg 離心lmin，以同樣的方法，用700 μ 1 Buffer W2再洗滌一次；棄濾液，將制備管置回到原來 的2ml離心管中，12000 Xg離心Imin ；將DNA制備管置于另一潔凈的1.5ml離心管中，在制 備管的膜中央加100-200 μ 1 Eluent或去離子水，室溫靜置lmin，12000 X g離心Imin洗脫 DNA。取5 μ 1待檢測DNA樣品和1 μ 1上樣緩沖液混合均勻，上樣于1.5%的瓊脂糖凝膠 (含0. 05% ΕΒ)，同時上樣DL2000Marker。120V電壓電泳lOmin，紫外燈下觀察電泳結(jié)果， 條帶亮且清晰，并且無拖帶現(xiàn)象，說明提取的基因組濃度及質(zhì)量較好，可進行下一步實驗操 作，如圖1所示。3.設(shè)計特異性引物并進行PCR擴增利用軟件01igo6. 0設(shè)計一對特異引物，引物序列上游引物 5，-CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3，，下游引物5，-CTTGACCTTC TCCCCAGTCA-3，，擴增片段長度 為201bp，引物由上海生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)總體系為50μ 1，其中IOX反應(yīng)緩 沖液5μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，1. Oumol/L的上游引物和下游引物各1 μ 1，IU TaqDNA聚 合酶，20-50納克基因組DNA，最后用四餾水補足至50 μ 1。循環(huán)程序如下95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，59°C復(fù)性45sec，72°C延伸 30sec，共35個循環(huán)。循環(huán)之后，72°C延伸lOmin。全部反應(yīng)完成后，PCR擴增產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測。二、建立PCR-SSCP檢測方法并鑒定突變位點本發(fā)明將PCR產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，結(jié)果檢測到三種基因 型TT型、TC型和CC型，如圖3所示，泳道3和6為TT型，泳道1，2，5，7為TC型，泳道4為 CC型。然后將兩種純合子TT型和CC型的目的片段克隆在PMD18-T載體上，而后轉(zhuǎn)化重組 質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定，最后把鑒定正確質(zhì)粒的進行測序。三、對標(biāo)記性狀進行關(guān)聯(lián)分析本發(fā)明通過肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析過程，對豬部分肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)分析并預(yù)測相應(yīng) 基因型個體部分肉質(zhì)性狀的潛力。肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)分析過程，是通過下述步驟實現(xiàn)的。
使用SPSS 13. 0軟件中的General Linear Model過程，建立如下統(tǒng)計分析模型并 消除系統(tǒng)效應(yīng)來分析不同基因型和部分肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計分析模型為=Yi = μ +G,ei。其中，Yi為被觀測個體的肉質(zhì)性狀表型值，μ為 肉質(zhì)性狀的最小二乘均值，G^為基因型對肉質(zhì)性狀的效應(yīng)值，e,為對應(yīng)于觀察值的隨機殘差。對豬第1內(nèi)含子的多態(tài)性位點與肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，基因型檢測結(jié)果表明在 156個個體中TT型基因型有48個，TC基因型個體有82個，CC型基因型個體有26個。分析 結(jié)果如表2所示，其中，同一性狀最小二乘均值及標(biāo)準(zhǔn)差后具有不同字母表示差異顯著(P < 0. 05)，具有不同小寫字母表示差異極顯著(P < 0. 01)。由表2可知，C等位基因是豬肉 質(zhì)性狀的有利等位基因，CC基因型標(biāo)記可作為用于提高豬大理石紋和肌間脂肪含量的選擇 標(biāo)記(分子標(biāo)記)，并對一些性狀提出預(yù)測值，最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)差即為對同一或不同品 種豬肉質(zhì)性狀。將此突變位點作為一個分子標(biāo)記，通過PCR-SSCP的方法鑒定此突變位點， 并將鑒定結(jié)果與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)聯(lián)，為豬的選種選育提供理論基礎(chǔ)。利用本發(fā)明建立的PCR-SSCP方法即可檢測任何品種的豬L-FABP基因型并進行評 估，提出部分肉質(zhì)性狀的估測值。本發(fā)明的效果是如下1.獲得豬L-FABP基因目的片段用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物擴增豬基因組DNA，得到201bp特異擴增片段。利用 PCR技術(shù)對目的片段進行體外擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示為特 異性PCR產(chǎn)物，如圖2所示。測序結(jié)果顯示該多態(tài)性片段存在T、C兩個等位基因，然后將兩 種純合子TT型和CC型的目的片段克隆在pMDIS-T載體上，而后轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒，提取質(zhì)粒進 行PCR鑒定，最后把鑒定正確質(zhì)粒的進行測序，測序峰圖如圖4所示。2.建立了豬L-FABP基因單核苷酸多態(tài)性PCR-SSCP診斷方法擴增的目的片段與去離子甲酰胺混合，接著95°C變性解鏈，再在冰水中驟冷快速 復(fù)性，使之成為具有一定空間結(jié)構(gòu)的單鏈DNA分子；將適量的單鏈DNA進行非變性聚丙烯酰 胺凝膠電泳；最后通過放射性自顯影、銀染或溴化乙錠顯色分析結(jié)果。結(jié)果可產(chǎn)生三種基因 型，即TT型、TC型和CC型，具體基因型如圖3所示。3.對標(biāo)記性狀進行關(guān)聯(lián)分析本發(fā)明運用SPSS13. 0軟件中的General Linear Model過程，將不同基因型與156 頭豬的肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，分析性狀包括部分肉質(zhì)性狀。分析結(jié)果見表2，分析結(jié)果 表明此多態(tài)性對所檢測的豬大理石紋有顯著影響(P < 0. 05)，而對肌間脂肪含量(IMF)有 極顯著影響(P < 0. 01)，大理石紋為CC型顯著高于TC型(P < 0. 05)，TC型顯著高于TT型 (P < 0. 05) ；IMF含量為CC型和TC型極顯著高于TT型(P < 0. 01)，而CC型和TC型之間 差異不顯著(P > 0. 05)；其它肉質(zhì)性狀的不同基因型之間差異不顯著(P > 0. 05)。表2部分肉質(zhì)性狀在TT、TC和CC基因型的最小二乘平均值及標(biāo)準(zhǔn)差


圖1是血液基因組DNA經(jīng)1. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分 子量Marker，1-6泳道為血液基因組DNA。圖2是L-FABP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo) 準(zhǔn)分子量DL2000Marker，1-7泳道為被檢測的7個PCR產(chǎn)物。圖3是L-FABP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果圖。泳 道3和6為TT型，泳道1，2，5和7為TC型，泳道4為CC型。圖4是本發(fā)明擴增的L-FABP基因TT型和CC型DNA序列的克隆測序峰圖。圖5是實施例1中PCR擴增產(chǎn)物的1. 5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo) 準(zhǔn)分子量DL2000Marker，1-2泳道為被檢測的2個PCR產(chǎn)物。圖6是實施例1中L-FABP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)12 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 結(jié)果圖。泳道1為TC型，泳道2為TT型。圖7是實施例2中PCR擴增產(chǎn)物的1. 5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo) 準(zhǔn)分子量DL2000Marker，1-2泳道為被檢測的2個PCR產(chǎn)物。圖8是實施例2中L-FABP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)12 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 結(jié)果圖。泳道1為TC型，泳道2為CC型。圖9是實施例3中PCR擴增產(chǎn)物的1. 5%瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果。其中M泳道為標(biāo) 準(zhǔn)分子量DL2000Marker，1-2泳道為被檢測的2個PCR產(chǎn)物。圖10是實施例3中L-FABP基因擴增產(chǎn)物經(jīng)12 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 結(jié)果圖。泳道1為TT型，泳道2為TC型。圖11是本發(fā)明的分子標(biāo)記鑒定方法和性狀關(guān)聯(lián)分析過程圖。
具體實施例方式為了更清楚地理解本發(fā)明，用具體實施方式
詳細(xì)描述具體內(nèi)容。本發(fā)明利用已公布的L-FABP基因序列和已提取的豬基因組DNA，設(shè)計特異性引物 一對，克隆內(nèi)含子1和外顯子2的一部分大約201bp，利用PCR-SSCP方法進行檢測，將非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果分型并將不同基因型與肉質(zhì)性狀關(guān)聯(lián)，并對不同基因型個體的 部分性狀預(yù)測，為豬的選種選育提供理論基礎(chǔ)。一、豬L-FABP基因目的片段的克隆1引物設(shè)計以豬 L-FABP 基因為參照，NCBI (National Center for Biotechnology Information，美國國家生物技術(shù)信息中心)收錄號為DQ182323，利用01igo6. 0軟件設(shè)計1 對特異性引物。引物序列如下所示上游引物5，-CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3，下游引物5，-CTTGACCTTCTCCCCAGTCA-3，擴增產(chǎn)物長度為201bp，引物由上海生物工程有限公司合成。
2PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))體系及擴增條件PCR反應(yīng)總體系為50μ 1，其中10X反應(yīng)緩沖液5μ 1，2. 5mmol/L dNTP 4μ 1, l.Oumol/L的上游引物和下游引物各1μ 1，1U Taq DNA聚合酶，20-50納克基因組DNA，最后 用四餾水補足至50 μ 1。循環(huán)程序如下95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，59°C復(fù)性45sec，72°C延伸 30sec，共35個循環(huán)。循環(huán)之后，72°C延伸lOmin。全部反應(yīng)完成后，PCR擴增產(chǎn)物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳檢測結(jié)果顯示為特異性PCR產(chǎn)物，見圖1，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子 量Marker DL2000,1-7泳道為被檢測的7個PCR產(chǎn)物。二、PCR-SSCP 方法的建立112%非變性聚丙烯酰胺凝膠制作及電泳首先清洗制膠用的玻璃板并用蒸餾水沖洗干凈，烘干后，用瓊脂糖封閉玻璃 板和膠條間的縫隙，為徹底將縫隙密封需在室溫下靜止30min再次補充的瓊脂糖；在 100ml燒杯內(nèi)加入30%丙烯酰胺12. 0ml, 5. Oml的50%甘油，5XTBE 10. 0ml, 10%過硫酸銨 350 μ 1, TEMED 8 μ 1，加入雙蒸水13. 0ml，混合后迅速灌膠；當(dāng)膠灌至離玻璃板上沿1. Ocm 時停止灌膠，插入梳子后再繼續(xù)灌膠至玻璃板上沿，室溫聚合30min，隨時觀察凝膠聚合情 況，并補加丙烯酰胺；凝膠聚合好后，向電泳槽加入1XTBE，用注射器沖洗加樣孔；在4°C下 130V預(yù)電泳lOmin，同時準(zhǔn)備點樣；取1 μ 1 PCR產(chǎn)物置于PCR管中，加5 μ 1變性Buffer， 離心混勻，98°C變性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射器點樣；打開電源，4°C下130V電 泳14 16h。2硝酸銀染色電泳結(jié)束后關(guān)上電泳儀，放出電泳液，小心取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩 器緩慢搖勻固定10 15min ；去離子水洗膠2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染 色30min ；去離子水洗膠3遍，每次2min，洗去多余的染色液；用200ml顯色液顯色，約10 30min，當(dāng)DNA帶的強度合適時，倒掉顯色液；去離子水洗掉多余的顯色液，掃描照相或保存。在該對引物的第25bp位置存在T/C等位突變，從而導(dǎo)致單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (single-strand conformation polymorphism)白勺產(chǎn)生。當(dāng)i亥位為 T 喊基時，經(jīng) 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果帶型為2條帶，這2條帶分別位于最上方和最下方；當(dāng)該 位點為C堿基時，經(jīng)12%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測結(jié)果帶型也為2條帶，但帶型與T堿基時不同，其下面1條帶位置位于T堿基時的上方；當(dāng)雜合子是為3條帶；如圖3所示，其 中3和6泳道為TT型，1，2，5和7泳道為TC型，4泳道為CC型。三、多態(tài)性片段的回收、純化及測序IPCR擴增產(chǎn)物的凝膠回收、純化本發(fā)明中對2個純合子即TT基因型和CC基因型的PCR擴增產(chǎn)物進行回收、純化 和測序，凝膠回收和純化使用常規(guī)方法即可。本發(fā)明中為快速、高效的回收PCR擴增產(chǎn)物， 使用Axygen公司AxyPr印基因組DNA小量試劑盒，具體操作參照其說明書進行，使用試劑 除IXTAE Buffer緩沖液和二餾水外均為試劑盒內(nèi)提供。在新鮮的IXTAE Buffer下，用 2.0%瓊脂糖/溴化乙啶凝膠電泳完全分離目的DNA片段。在長波紫外燈下用潔凈的手術(shù)刀 片快速切取含目的DNA片段凝膠條。在干凈的1. 5ml離心管中稱量所切膠塊的重量，計算 膠塊的體積(按Ig為Iml計算，為保證回收量，回收的膠塊重量應(yīng)在50mg至350mg之間)， 加1 3體積的Extraction Buffer, 55°C _65°C孵育7min或直到膠塊完全融化，每2_3min 搖動一次混合均勻；按1 1的比例(凝膠質(zhì)量毫克數(shù)異丙醇體積微升數(shù))加入異丙醇， 并混合均勻。將混合液全部轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，于6000g離心一分鐘，并棄去接液管內(nèi) 液體。向 Spin column 內(nèi)力卩 500 μ 1 Extraction Buffer，于 12000g 離心 30_60sec，并棄去 接液管內(nèi)液體。向 Spin column 內(nèi)力口 750 μ 1 Wash Buffer，于 12000g 離心 30_60sec，并棄 去接液管內(nèi)液體。棄濾液，將空的Spin Column 12000g離心lmin，然后將Spin Column放 入一個干凈滅菌的1. 5ml離心管中。向Spin Column內(nèi)加30 μ 1 Elution Buffer或滅菌 的去離子水到柱子的中央，并于室溫靜置一分鐘。12000g離心Imin洗脫DNA。2感受態(tài)DH5 α宿主菌的制備用CaCl2法制備大腸埃希氏DH5 α (Ε. coli DH5 α )感受態(tài)宿主菌，整個過程需在嚴(yán) 格的無菌條件下進行。方法如下從37°C培養(yǎng)16至20h的LB(Luria-Bertani)平板培養(yǎng)基 中挑取新活化的E. coli DH5a單菌落于不加氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37°C每分鐘200至 220轉(zhuǎn)振蕩培養(yǎng)12h，然后取300微升于50 μ 1裝有LB的錐形瓶中，柔和搖晃2h，OD600值為 0. 45至0. 55。取冰中預(yù)冷IOmin的E. coli DH5 α菌液于冰上預(yù)冷的離心管中，在4°C下 每分鐘4500轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心lOmin。取25ml冰浴預(yù)冷的0. 075Mol/L的CaCl2-Tris-Cl懸浮 沉淀，置于冰浴15min。在4°C下每分鐘4500轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速離心lOmin，棄上清液后，倒置lmin。 加2ml冰浴預(yù)冷的CaCl2-甘油重懸沉淀。每管200 μ 1分裝至1. 5ml離心管內(nèi)，在_80°C保 存。3目的片段與克隆載體的連接可根據(jù)實際情況選擇合適的載體。本發(fā)明為快速、高效的進行載體連接，選用了 TaKaRa公司的pMD18_T載體連接試劑盒進行目的片段與克隆載體的連接，除四餾水外，其 他所有試劑均為試劑盒內(nèi)提供。將凝膠回收的目的DNA片段連接到pMD-18T載體上。按照 表3的連接反應(yīng)體系，在200 μ 1高壓滅菌的微量離心管中加入表3中所列的組分，混勻， 16°C 連接 12-16h。表3連接反應(yīng)體系 4重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化在每管200 μ 1冰上凍融的感受態(tài)細(xì)胞中，加入10 μ 1的連接產(chǎn)物，輕彈管壁以混 勻內(nèi)容物，冰浴45min。將離心管放入預(yù)熱的42°C恒溫水浴中靜置2min?？焖賹㈦x心管轉(zhuǎn) 移到冰中，冰浴5min。在離心管中加入200 μ 1 LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床每分鐘150轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn) 速溫浴1. 5h。5陽性克隆的篩選將LB固體培養(yǎng)基15psi(1.05kg/cm2)高壓蒸汽滅菌20min，冷卻至60°C時，加 入lmllOOyg/y 1的氨芐青霉素(AMP)Uml 24 μ g/ μ 1的異丙基-B-D-硫代半乳糖苷 (IPTG)、2 μ 1 20 μ g/ μ 1的5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-乳糖苷(X-Gal)后均勻混合，鋪制 平板。取100 μ 1轉(zhuǎn)化后的細(xì)菌均勻涂布于培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)箱中放置lh。然后將平板 倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-16h后將平板移入4°C放置，以使藍色充分顯現(xiàn)。觀察藍色 與白色菌落生長情況，為使每條目的帶的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物覆蓋5’和3’末端全序列，挑取陽性菌落 (白色)5-10個接種于LB培養(yǎng)基。6重組質(zhì)粒的提取可使用常規(guī)方法進行重組質(zhì)粒的提取。本發(fā)明為快速、高效進行重組質(zhì)粒的提 取，選用Omega公司的E.Z. N. A. Plasmid Mini Kit I試劑盒提取陽性質(zhì)粒DNA，除四餾 水、去離子水外，所用試劑均為試劑盒內(nèi)提供。從平板培養(yǎng)基上挑選單個陽性菌落接種到 5ml 50 μ g/ml的LB/Ampicillin液體培養(yǎng)基中，37°C每分鐘220轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)速恒溫振蕩，培養(yǎng) 12-16h。取5ml菌液放入離心管中，室溫IOOOOg離心lmin，棄掉上面的上清液。用250 μ 1 的含RNA去除酶的Solution I充分懸浮細(xì)胞沉淀。加入250 μ 1的Solutionll，輕輕地 上下翻轉(zhuǎn)混合4 6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液，室溫放置2min。加入350 μ 1的 Solutionlll，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5至6次，直至形成緊實凝集塊，室溫IOOOOg離心lOmin。 將試劑盒中的HiBind DNAMinicolumn放置于2ml的Collection Tube上，將上述帶有凝 集塊混合液的上清液轉(zhuǎn)移至HiBind DNA Minicolumn中，室溫IOOOOg離心lmin。棄掉濾 液，加入 500 μ 1 的 Buffer HB 到 HiBind DNA Minicolumn,然后室溫 IOOOOg 離心 lmin。 離心完畢后棄掉濾液，加700μ 1用乙醇稀釋過的DNA Wash Buffer清洗HiBind DNA Minicolumn,室溫IOOOOg離心lmin,棄掉濾液。然后室溫IOOOOg離心空的HiBind DNA Minicolumn lmin，干燥基質(zhì)。干燥完畢后將HiBind DNA Minicolumn安置于新的滅菌過 的1. 5ml的離心管上，在HiBind DNAMinicolumn中的膜的中央處加入60 μ 1滅菌的去離 子水，室溫靜置Imin后，IOOOOg離心Imin洗脫DNA，可以再洗脫一次提高產(chǎn)量，在-20°C貯 存。7陽性質(zhì)粒的PCR鑒定及測序以重組質(zhì)粒為模板進行PCR鑒定，反應(yīng)體系及擴增條件不變，將鑒定正確的重組 質(zhì)粒送測序公司進行序列測定。本發(fā)明中，重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公 司測序。
四、對標(biāo)記性狀進行關(guān)聯(lián)分析利用已測定肉質(zhì)性狀的156頭豬基因組DNA樣品(基因組DNA提取自血液)，對標(biāo) 記性狀進行關(guān)聯(lián)分析，分析性狀包括肉質(zhì)性狀。運用SPSS13. 0軟件中的General Linear Model過程，建立如下模型并消除系統(tǒng)效應(yīng)來分析不同基因型和性狀間的關(guān)聯(lián)。統(tǒng)計分析模型為=Yi = μ +G廣ei。其中，Yi為被觀測個體的生產(chǎn)性能表型值；μ為 生產(chǎn)性能的最小二乘均值&為基因型對生產(chǎn)性能的效應(yīng)值&為對應(yīng)于觀察值的隨機殘 差。實施例1在中國吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧分院的大白豬中隨機抽取2個6月齡的個體，在肉 質(zhì)測定時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關(guān)的性狀資料。提取的基因組DNA 經(jīng)分光光度儀測定，濃度為37. 19ug/ml, 0D260/0D280Ratio為1. 816。利用本發(fā)明設(shè)計的 引物、PCR反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為50 μ 1，其中IOX反應(yīng)緩沖 液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1，0.1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ l,25mmol/L MgCl23 μ 1，引物濃度為1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1 μ 1，1 μ 1 (2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因組DNA(含31. 68ng基因組DNA)，四餾水36 μ 1。PCR反 應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，59°C復(fù)性45sec，72°C延伸30sec，共35個循 環(huán)。最后，72°C延伸lOmin。全部反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果 顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖5所示，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，泳道1和2為被檢 測的2個PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計的SSCP方法進行檢測。取Ιμ PCR產(chǎn)物置 于PCR管中，加5μ 1變性Buffer，離心混勻，98°C變性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器點樣于事先配制好的12%非變性聚丙烯酰胺凝膠點樣孔中；打開電源，4°C下130V電泳 14 16h。電泳結(jié)束后取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10 15min ； 去離子水洗膠2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去離子水洗膠3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml顯色液顯色，約10 30min，當(dāng)DNA帶的強度合適 時，倒掉顯色液；去離子水洗掉多余的顯色液，掃描照相或保存，并記錄其基因型。如圖6所 示，其中泳道1和2為被檢測2個個體的SSCP結(jié)果。經(jīng)鑒定，此泳道1個體屬于TC型，泳 道2個體屬于TT型。其性狀與本發(fā)明所預(yù)測的值的對比見表4。表4實施例1中抽取的個體性狀測量值與預(yù)測值對比 實施例2在吉林大學(xué)原種豬場中飼養(yǎng)的長白豬中隨機抽取2個5月齡的個體，在肉質(zhì)測 定時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關(guān)的性狀資料。提取的基因組DNA經(jīng) 分光光度儀測定，濃度為36. 37ug/ml, 0D260/0D280Ratio為1. 806。利用本發(fā)明設(shè)計的 引物、PCR反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為50 μ 1，其中IOX反應(yīng)緩沖 液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1,0. 1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ 1，25讓ol/LMgCl23y 1，引物濃度為1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1μ 1，1μ 1(2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因組DNA(含31. 68ng基因組DNA)，四餾水36 μ 1。PCR反 應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，59°C復(fù)性45sec，72°C延伸30sec，共35個循 環(huán)。最后，72°C延伸lOmin。全部反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果 顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖7所示，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，泳道1和2為被檢 測的2個PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計的SSCP方法進行檢測。取Ιμ PCR產(chǎn)物置 于PCR管中，加5μ 1變性Buffer，離心混勻，98°C變性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器點樣于事先配制好的12%非變性聚丙烯酰胺凝膠點樣孔中；打開電源，4°C下130V電泳 14 16h。電泳結(jié)束后取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10 15min ； 去離子水洗膠2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去離子水洗膠3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml顯色液顯色，約10 30min，當(dāng)DNA帶的強度合適 時，倒掉顯色液；去離子水洗掉多余的顯色液，掃描照相或保存，并記錄其基因型。如圖8所 示，其中泳道1和2為被檢測2個個體的SSCP結(jié)果。經(jīng)鑒定，此泳道1個體屬于TC型，泳 道2個體屬于CC型。其性狀與本發(fā)明所預(yù)測的值的對比見表5。表5實施例2中抽取的個體性狀測量值與預(yù)測值對比 實施例3在吉林大學(xué)原種豬場飼養(yǎng)的軍牧1號白豬中隨機抽取2個7月齡的待肉質(zhì)個體， 在肉質(zhì)時采集血液進行基因組DNA的提取并整理其相關(guān)的性狀資料。提取的基因組DNA 經(jīng)分光光度儀測定，濃度為37. 53μ g/ml，0D260/0D280比率為1. 834。利用本發(fā)明設(shè)計的 引物、PCR反應(yīng)體系和條件進行PCR擴增。PCR反應(yīng)總體系為50 μ 1，其中IOX反應(yīng)緩沖
12液[10mmol/LTris-HCL(PH8. 0),50mmol/L KC1，0.1 % TritonX-100]4 μ l,10mmol/L dNTP 2μ l,25mmol/L MgCl23 μ 1，引物濃度為1. Oumol/L，上游引物和下游引物各1 μ 1，1 μ 1 (2U/ ul)Taq DNA聚合酶，2 μ 1提取的基因組DNA(含31. 68ng基因組DNA)，四餾水36 μ 1。PCR反 應(yīng)條件為95°C預(yù)變性5min，95°C變性30sec，59°C復(fù)性45sec，72°C延伸30sec，共35個循 環(huán)。最后，72°C延伸lOmin。全部反應(yīng)完成后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果 顯示為特異性PCR產(chǎn)物。如圖9所示，其中M泳道為標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker，泳道1和2為被檢 測的2個PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物按本發(fā)明設(shè)計的SSCP方法進行檢測。取Ιμ PCR產(chǎn)物置 于PCR管中，加5μ 1變性Buffer，離心混勻，98°C變性IOmin ；迅速冰浴lOmin，用微量注射 器點樣于事先配制好的12%非變性聚丙烯酰胺凝膠點樣孔中；打開電源，4°C下130V電泳 14 16h。電泳結(jié)束后取下凝膠，置于70%乙醇中，水浴震蕩器緩慢搖勻固定10 15min ； 去離子水洗膠2遍，每次2min，洗去乙醇；用200ml染色液染色30min ；去離子水洗膠3遍， 每次2min，洗去多余的染色液；用200ml顯色液顯色，約10 30min，當(dāng)DNA帶的強度合適 時，倒掉顯色液；去離子水洗掉多余的顯色液，掃描照相或保存，并記錄其基因型。如圖10 所示，其中泳道1和2為被檢測2個個體的SSCP結(jié)果。經(jīng)鑒定，此泳道1個體屬于TT型， 泳道2個體屬于TC型。其性狀與本發(fā)明所預(yù)測的值的對比見表6。表6實施例3中抽取的個體性狀測量值與預(yù)測值對比 SEQUENCE LISTING<110>吉林大學(xué)<120>L-FABP<130>L-FABP<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1
<211>201<212>DNA<213>Sus scrofa
<220>
<221>misc_feature
<223>n
<400>1
cccctcagcctccaatgcctttcatcaggt ctgcccgacg aactcatcca gaaggggaag
gacatcaaggggacatcggaaatcgtgcag aatgggaagc acttcaagtt gaccatcact
accgggtccaaggtcgtccagaatgagttc accttgggag aggagtgtga gatggagacc
ctgactggggagaaggtcaag
60 120 180 20權(quán)利要求
豬L FABP基因作為肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記，它的核苷酸序列如序列表SEQUENCELISTING所述，在序列表的第25bp處(內(nèi)含子1處)有一個T→C的堿基突變，從而導(dǎo)致了單鏈構(gòu)象多態(tài)性的產(chǎn)生。
2.檢測權(quán)利要求1所述堿基突變的引物對的DNA序列如下所示 正向引物5 ~ -CCCCTCAGCCTCCAATGCCT-3 “，反向引物5 ~ -CTTGACCTTCTCCCCAGTCA-3 “。
3.權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在豬分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于動物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種作為豬分子標(biāo)記輔助選擇應(yīng)用的與豬肉質(zhì)性狀相關(guān)的分子標(biāo)記的制備及應(yīng)用，所述的豬肉質(zhì)性狀涉及肌間脂肪含量，眼肌面積，熟肉率，滴水損失和肌纖維直徑等相關(guān)性狀。本發(fā)明制備的分子標(biāo)記從豬L-FABP基因中克隆得到，所述的分子標(biāo)記的核苷酸序列如序列表SEQUENCE LISTING所示，在序列表SEQUENCE LISTING的第25bp處(內(nèi)含子1處)有一個T→C的堿基突變，從而導(dǎo)致了單鏈構(gòu)象多態(tài)性的產(chǎn)生。本發(fā)明還公開了擴增L-FABP基因部分DNA序列所用的引物以及用于多態(tài)性檢測方法，為豬的標(biāo)記輔助選擇提供了一個新的分子標(biāo)記。
文檔編號C12Q1/68GK101921845SQ20101023008
公開日2010年12月22日 申請日期2010年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月18日
發(fā)明者劉殿峰, 姜昊, 孫博興, 張嘉保, 張樹敏, 張永宏, 袁寶, 趙志輝, 馬騰壑, 高妍 申請人:吉林大學(xué)