專利名稱：篩選核酸以尋找核苷酸變異的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明與在核酸中探測(cè)核苷酸變異的領(lǐng)域有關(guān)。更具體地說，本發(fā)明有關(guān)在核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法。該方法從樣品獲得一種核酸的不同長(zhǎng)度的拷貝，把它們與參照核酸雜交并檢測(cè)在這些不同長(zhǎng)度的核酸的3’末端位點(diǎn)或3’末端倒數(shù)第二個(gè)位點(diǎn)上是否存在核苷酸變異。
領(lǐng)域背景隨著人類基因組序列的破譯，與基因突變相關(guān)連的疾病數(shù)目持續(xù)增長(zhǎng)。核酸的測(cè)序是檢測(cè)核苷酸變異的主要方法。它非常適用于在目標(biāo)核酸片段上檢測(cè)未知的突變或多態(tài)現(xiàn)象，這些現(xiàn)象可能出現(xiàn)在任何堿基上。酶法DNA測(cè)序是最常用的方法，從它開始(Sanger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,74,5463(1977))就基本上沒有什么變化。諸如引入熒光染色、機(jī)器人和自動(dòng)檢測(cè)的電泳系統(tǒng)，這些技術(shù)改善了本領(lǐng)域并產(chǎn)生了它的自動(dòng)化。然而，如果樣品中遺傳變異的發(fā)生頻率很低，這種自動(dòng)化的成本對(duì)于大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室來說都將太高。于是本領(lǐng)域需要一種用于測(cè)序之前的簡(jiǎn)便廉價(jià)的方法來篩選核酸尋找核苷酸變異。
眾多篩選未知突變的方法的形成使本領(lǐng)域的這種需求非常明顯。單鏈構(gòu)象多態(tài)型(SSCP)通過與已知樣品比較在非變性凝膠中單鏈狀態(tài)的遷移率來探測(cè)未知樣品中的突變，該方法由Orita et al.提出，Genomics,5:874-879(1989)。核苷酸序列的變化影響DNA分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)或構(gòu)象以致改變其電泳時(shí)的遷移率。然而，這一技術(shù)限于200bp以內(nèi)的目標(biāo)DNA，敏感性較低，再現(xiàn)需要嚴(yán)格的電泳條件。SSCP分析有了一些改進(jìn)，例如雙脫指紋技術(shù)-包括雙向(Liu et al.,HumMol.Genet.,5:107-114(1996))和單向(Sarkar et.al.,Genomics,13:441-443(1992))，以及限制性內(nèi)切酶指紋技術(shù)(Liu andSommer.Biotechniques,18:470-477(1995))，這些技術(shù)能夠探測(cè)大于1kb的片段上的突變，但它們使得DNA片段結(jié)構(gòu)復(fù)雜化從而使敏感度降低，探測(cè)突變變難。
在核酸中篩選核苷酸突變的另一種方法基于它們?cè)谀z基質(zhì)中遷移時(shí)異源雙鏈分子不同的遷移率，這一方法的最簡(jiǎn)形式被叫做異源雙鏈分析，首次見于Nagamine et al.(Am.J Hum Genet.,45,337-339(1989))，一段未鑒定的DNA片段，通常為擴(kuò)增物或PCR產(chǎn)物，與相應(yīng)的野生型片段混和，加熱，使之慢慢地復(fù)性。如果未鑒定的片段與野生型的片段序列不同便形成了異源雙鏈分子堿基的錯(cuò)配改變了異源雙鏈分子在非變性凝膠中的遷移率，使之與同源雙鏈分子部分分離。
還有一種更加靈敏的方法叫做變性梯度凝膠電泳(DGGE)，使異源雙鏈分子在凝膠中遭遇呈梯度增加的變性劑。首次描述于Fisherand Lerman(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,80:1579-1583(1983))。隨著異源雙鏈分子在變性劑中遷移，它們開始熔解變性，使得遷移減緩并不再呈線性。對(duì)于同源雙鏈分子來說熔解溫度略不有同，使得異源雙鏈分子能夠部分地分離，為了獲得再現(xiàn)的結(jié)果，需要精確控制場(chǎng)強(qiáng)度、溫度和時(shí)間，因此要不斷重復(fù)再現(xiàn)有一定困難。
對(duì)于恒定變性凝膠電泳(CDGE)來說，這些變量就稍不重要，因?yàn)檎麄€(gè)凝膠中變性劑的濃度是恒定的(Hoving et al.,Mut.Res.,262:63-71(1991))。一個(gè)核酸片段可能含有不止一個(gè)的熔解結(jié)構(gòu)域，這樣就不得不在不同的凝膠中制備不同的變性劑濃度用以電泳。這是CDGE的一大限制因素。
時(shí)序溫度梯度凝膠電泳(TTGE)希望通過逐步升高電泳過程中的溫度來規(guī)避CDGE的問題，見Borresen et al.(Bioradiations,99:12-113(1997))。這是CDGE和溫度梯度凝膠電泳這兩種技術(shù)的結(jié)合產(chǎn)物。溫度梯度凝膠電泳僅僅把溫度作為一種變性劑(Rosnbaum andRiesner,Biophys.Chem.,26:235-246(1987))。正如料想的一樣，這一技術(shù)也難于實(shí)施并很難重現(xiàn)。
最近問世的一項(xiàng)技術(shù)叫做堿基切除序列掃描(BESS)，它由使用ddTTP的雙脫氧指紋技術(shù)改進(jìn)而來，免去了單獨(dú)的測(cè)序反應(yīng)(Epicentre Technologies,Madison,WI.)使用標(biāo)記引物和限量的dUTP對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用尿嘧啶DNA糖基酶處理，在尿嘧啶位點(diǎn)處剪切。片段經(jīng)過變性凝膠電泳后產(chǎn)生的梯與雙脫氧胸腺嘧啶序列梯幾乎完全相同。這一技術(shù)適用于篩選1kb以上片段DNA上的突變，但受到凝膠電泳分辨率的限制并且不能檢測(cè)出G到C或C到G的突變。
另一種最近問世的技術(shù)使用一種叫做剪切酶的結(jié)構(gòu)特異性內(nèi)切酶去消化鏈內(nèi)結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生片段長(zhǎng)度多態(tài)型(CFLP)，見于Brow etal.,J.Clin.Microbiol.,34:3129～3137(1996)。這種結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生是通過先將一段DNA片段變性然后快速冷卻到消化溫度并加入酶。由于序列變異，特定片段DNA的折疊方式可能受到改變，通過用酶消化可在變性凝膠中產(chǎn)生一種獨(dú)特的條帶圖形。然后，這一技術(shù)受到凝膠電泳分辨率的極大限制，這一過程中產(chǎn)生的DNA條帶的復(fù)雜圖形也使探測(cè)突變較為困難。
通過化學(xué)或酶切割在于異源雙鏈DNA中的錯(cuò)配堿基以探測(cè)突變，這一方法見于Noack et al.,Proc Natl Alad.Sci.U.S.A.,83:586-590(1986),Cotton et al.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:4394-4401(1988),Cotton et al.,U.S.Pat.No.5,202,231,(Winter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:7575-7579(1989),Myers et al.,Science,230:1245-1246(1985)),(Luand Hsu,Genomics,14:249-255(1992))和U.S.Pat.No.5,698,400。這些技術(shù)中的大多數(shù)都因?yàn)榧羟性噭o法識(shí)別所有類型的堿基錯(cuò)配而受到限制，另外一些技術(shù)可通過分析DNA片段的每一條鏈來克服這一限制。到目前為止，還沒有發(fā)現(xiàn)這些技術(shù)的大規(guī)模使用，因?yàn)樗鼈冃枰獎(jiǎng)《痉磻?yīng)試劑并且它們的操作很難完成。
把DNA雜交過程微縮到一種小的固體表面上，即大家所知的DNA蕊片或微陣列，使得對(duì)于DNA片段的分析不再需要凝膠電泳。參見Macevicz,U.S.Pat.No.5,002,867,Drmanac.,U.S.Pat.No.5,202,231,Lipshutz et al.,Biotechniques,9(3)442～447(1995)和Chee etal.Science,274:610～614(1996))。然而，由于凝膠電泳的分辨率問題，前面所述的突變檢測(cè)技術(shù)，包括DNA測(cè)序在內(nèi)，都受到DNA片段大小的嚴(yán)格限制，這一方法中設(shè)備和蕊片的高成本限制了它的廣泛使用。
本發(fā)明在這些以前的方法的基礎(chǔ)上作了需要的改進(jìn)并提供了一系列方法，用它們可以檢測(cè)到任何可能的堿基變異，包括單個(gè)和多個(gè)堿基替換，插入和缺失。這些突變可以發(fā)生在一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上并且影響每個(gè)位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。第二，作為一種篩選方法，本發(fā)明會(huì)產(chǎn)生非常明顯的陽性或陰性結(jié)果。第三，本方法不受凝膠電泳分辨能力的限制因此可以對(duì)大于1kb的DNA片段進(jìn)行分析。最后，因?yàn)闊o需電泳檢測(cè)，本方法非常適于自動(dòng)化因此適合大規(guī)模的篩選。
發(fā)明概述正如這里實(shí)施和廣泛描述的，本發(fā)明符合其目的，在一方面，它有關(guān)于在初始核酸中探測(cè)核苷酸變異的一種方法，包括在存在修飾核苷酸條件下產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的單鏈延伸產(chǎn)物，這些延伸產(chǎn)物包含修飾的核苷酸并借此抑制核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基的外切酶活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，并使用一種酶作用于雜交的核酸。在存在選擇性標(biāo)記的核苷酸的條件下，可用該酶切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸。這樣，那些在3’末端處無法與參照核酸對(duì)應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物在相應(yīng)的位置被替換以一個(gè)或多個(gè)可與參照核酸雜交的核苷酸。這樣就可以把在3’末端可與參照核酸雜交的和不可與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，并由此探測(cè)初始核酸上的核苷酸變異。
本發(fā)明又另外提供一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法，包括在存在修飾的核苷酸的條件下產(chǎn)生一系列單鏈延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物中的修飾核苷酸可抑制核酸外切酶對(duì)3’末端堿基的活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，并用一種酶處理，在存在選擇性修飾的核苷酸條件下，該酶可以切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸。這種被替換上去的選擇性修飾核苷酸不會(huì)被再次替換而且可以抑制延伸產(chǎn)物的進(jìn)一步延伸，而以非修飾核苷酸為末端的延伸產(chǎn)物則可以進(jìn)一步的延伸，從而與那些不能進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來。去除沒有引入的選擇性修飾的核苷酸，延伸那些可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物，把可繼續(xù)延伸的和不可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，從而檢測(cè)初始核酸中的核苷酸變異。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法，包括在存在修飾核苷酸堿基和鏈終止核苷酸堿基的條件下，產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的延伸產(chǎn)物，它們包含修飾的核苷酸，可以抑制核酸外切酸對(duì)于3’末端核苷酸堿基的活性。這延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，之后在存在三磷酸脫氧核苷酸的條件下，用一種可以切除并替換延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的酶去處理雜交核酸。3’末端的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸不會(huì)被切除，因此如果在這一位置上含有不能與參照核酸配對(duì)的核苷酸，它不能被替換掉，因此不能夠進(jìn)一步地延伸。延伸那些可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物，把可以進(jìn)一步延伸和不可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，從而檢測(cè)出初始核酸中的核苷酸變異。
附圖簡(jiǎn)述

圖1為單堿基延伸模板交換反應(yīng)延伸檢測(cè)方法的圖示。
圖2為延伸檢測(cè)法圖示。
圖3為使用抗外切酶活性末端的非延伸模板交換延伸反應(yīng)檢測(cè)法圖示。
圖4為使用3’末端雙脫氧核苷酸的非延伸模板變換延伸反應(yīng)檢測(cè)法圖示。
發(fā)明詳述通過參考以下對(duì)于本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述以及其中的實(shí)施例，我們可以更容易地理解本發(fā)明。
在說明和描述本實(shí)驗(yàn)中的化合物和方法之前，我們需要知道本發(fā)明不限于特定的核酸、鏈終止核苷酶，剪接酶，延伸和/或擴(kuò)增酶，可探測(cè)成分以及其他本發(fā)明中使用的試劑，它們當(dāng)然可以變通使用，我們還需認(rèn)識(shí)到這里所使用的術(shù)語是為了描述特定的實(shí)驗(yàn)方案而不是為了去限制。
必須指出，在本說明書和所附的權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”、“這”包括有復(fù)數(shù)的含義，除非上下文明確指出不是這樣。因此，例如，提到“一種核酸”包括該核酸的多個(gè)拷貝而且可能包含不止一種種類的分子。
一方面，本發(fā)明有關(guān)于在初始核酸中探測(cè)核苷酶變異的一種方法，包括在存在修飾核苷酸的條件下產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的單鏈延伸產(chǎn)物。這些延伸產(chǎn)物包含有修飾的核苷酸，它們借此抑制核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基的活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，并使用一種酶作用于雜交后的核酸。在存在選擇性標(biāo)記的核苷酸的條件下，可用該酶切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸。這樣那些在3’末端處無法與參照核酸對(duì)應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物在相應(yīng)的位置被替換以一個(gè)或多個(gè)可與參照核酸雜交的核苷酸。這樣就可以把在3’末端可與參照核酸雜交的和不可與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，并由此探測(cè)初始核酸上的核苷酶變異。
這里所說的核酸變異是指在一種核酸(初始核酸)的一個(gè)或多個(gè)位點(diǎn)上發(fā)生的替換、插入或缺失，或它們的組合。例如，一種核酶可能在被分析的某一區(qū)域有一個(gè)堿基被替換，或者在該區(qū)域有多個(gè)堿基被替換，或者發(fā)生任何堿基替換、插入和缺失的組合。這里所說的核酸變異也指任何可以引起表現(xiàn)型或基因型改變的核苷酸修飾。這里所描述的方法可以探測(cè)堿基替換、缺失、插入或任何其他的突變，這種突變導(dǎo)致一種核酸上的核苷酸無法與另一條獨(dú)立的，至少部分互補(bǔ)的核酸上的相應(yīng)核苷酸發(fā)生雜交。
初始核酸可以是一種來源于樣品，即一個(gè)病人或?qū)嶒?yàn)樣品，的單鏈或雙鏈核酸。參照核酸可以是一種標(biāo)準(zhǔn)的或用于參照的核酸，初始核酸可與之雜交和/或比較。在這里所描述的方法中，初始核酸的一條或多條鏈被用于生成一系列至少部分抗3’→5’外切酶活性的單鏈延伸產(chǎn)物，這里延伸產(chǎn)物選擇性地含有鏈終止核苷酸或在它們的3’末端含有脫氧核苷酸，以便生成的一系列延伸產(chǎn)物具有不同的長(zhǎng)度。
本發(fā)明中所用的初始核酸的生產(chǎn)和分離可通過目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增而簡(jiǎn)化?？梢园涯繕?biāo)區(qū)域克隆到諸如質(zhì)?；蚴删w的復(fù)制載體上，然后生成雙鏈或單鏈的分子，如果初始核酸是通過克隆該核酸而得到的，在核酸被復(fù)制之后，則有許多已知的方法用于從克隆載體上分離核酸，如噬菌體分離，質(zhì)粒分離，首先裂解菌體，對(duì)細(xì)胞蛋白作變性處理，最后離心核酸，或者甚至通過密度梯度離心產(chǎn)生質(zhì)粒或噬菌體的核酸的密度條帶。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到還有許多其他的擴(kuò)增技術(shù)可用于生成核酸一條或多條鏈的拷貝，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，其他的擴(kuò)增技術(shù)也可以用來擴(kuò)增一種核酸，自動(dòng)維持序列擴(kuò)增(3SR)系統(tǒng)，基于轉(zhuǎn)錄的擴(kuò)增系統(tǒng)(TAS)，和基于Qβ復(fù)制酶的RNA復(fù)制系統(tǒng)。因此，擴(kuò)增的產(chǎn)物，初始核酸，和/或參照核酸可能是RNA或DNA，可能是單鏈，也可能是雙鏈。如果擴(kuò)增產(chǎn)物是雙鏈的，分離出單鏈的方法在本領(lǐng)域已為人們熟知，如使用與生物素聯(lián)接的擴(kuò)增引物或使用lambda外切核酸酶對(duì)磷酸化的鏈進(jìn)行選擇性地降解，見Higuchi and Ochman，NucleicAcids Research,17:5865(1989)，本領(lǐng)域還有其他一些可選的方法用于生成單鏈的模板，如不對(duì)稱PCR(Ausbel et al,“Current Protocolsin Molecular Biology”,John Wiley&Sons,New York(1987)),和固相捕獲(Holtman et al.,Nucleic Acids Research,17:4937-4946(1989))，如果擴(kuò)增的產(chǎn)物是RNA，可以使用本領(lǐng)域中熟知的技術(shù)如使用反轉(zhuǎn)錄酶從RNA生成DNA。
不管這里描述的方法中的初始核酸是經(jīng)過擴(kuò)增的，或者經(jīng)是直接獲得的，如來源于病人樣品或任何其他實(shí)驗(yàn)樣品，最終該核酸作為模板用于生成一系列不同長(zhǎng)度的單鏈延伸產(chǎn)物。例如，在反應(yīng)中可以使用鏈終止雙脫氧核苷酸生成的一系列單鏈延伸產(chǎn)物在雙脫氧核苷酶引入的每一個(gè)位置發(fā)生終止。更好的情況是，這一系列長(zhǎng)度變化的單鏈延伸產(chǎn)物中，在每一個(gè)可能的位置上引入特定種類的雙脫氧核苷酸的延伸產(chǎn)物的數(shù)目至少是一，也就是形成“序列梯”，生成雙脫氧序列梯在本領(lǐng)域?yàn)槿耸熘?，可通過已商業(yè)化的序列試劑盒完成。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，是通過溫度循環(huán)序列形成多數(shù)與初始核酸對(duì)應(yīng)的序列梯以易于后來的檢測(cè)工作。探測(cè)出3’末端核苷酸可以與參照核酸相應(yīng)位置雜交的和不可與之雜交的單鏈延伸產(chǎn)物。
做為選擇，還有許多其他的方法可用來制備長(zhǎng)度不同的單鏈延伸產(chǎn)物。例如，可以不在反應(yīng)混合物中添加鏈終止核苷酸，而是限制脫氧核苷酸的量。另外，也可以使用足量的脫氧核苷酸合成與初始核酸全長(zhǎng)相應(yīng)的單鏈延伸產(chǎn)物，然后對(duì)它們進(jìn)行部分末端水解，如使用核酸外切酶Ⅰ或Ⅲ，或T4 DNA聚合酶，最終制得不同長(zhǎng)度的單鏈延伸產(chǎn)物，本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道用于制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物的特定技術(shù)可以變化。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員也會(huì)認(rèn)識(shí)到制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物將需要一種引物以便使延伸反應(yīng)能夠進(jìn)行。該引物可以是本身的，如同一分子3’區(qū)到5’區(qū)的雜交。該引物也可以不是自身的，例如可以使用合成的引物與初始核酸的相應(yīng)位置進(jìn)行雜交。
初始核酸、單鏈延伸產(chǎn)物，還有引物，它們都可以經(jīng)過修飾，如與生物素、地高辛配基、半抗原、抗體、酶或其他部分相連，以利于分子的分離和/或檢測(cè)。正如在實(shí)施例部分討論的，引物可以與生物素相連，使用這種修飾的引物所制備的一系列單鏈延伸產(chǎn)物可以通過使用包裹鏈霉親和素的磁珠從而與初始核酸以及延伸反應(yīng)的其他成分分離開來。
任選地，這些被修飾的初始核酸，單鏈延伸產(chǎn)物，和/或引物可以被吸附到固體支撐物上從而從反應(yīng)混和物和/或其他核酸中得到分離或純化。例如，一種至少部分與引物互補(bǔ)的核酸可以被連接到固體支撐物上，如柱色譜中使用的珠子，引物被延伸之后，反應(yīng)混合物加熱到一定溫度，使延伸產(chǎn)物與初始核酸變性。把這一混合物過柱，與珠子相連的核酸只與延伸產(chǎn)物雜交而不與初始核酸雜交，借此延伸產(chǎn)物從初始核酸中純化出來。又例如，引物可包含與初始核酸互補(bǔ)的序列同時(shí)含有一段5’區(qū)域不與初始核酸互補(bǔ)，例如一個(gè)poly(C)區(qū)域，在延伸產(chǎn)物無法與初始核酸雜交的條件下，珠子上連結(jié)的核酸可包含poly(G)區(qū)域以便與poly(C)區(qū)域雜交。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到還有許多其他的方法可用于分離延伸反應(yīng)中的一條鏈和與之互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的鏈，這里所描述的方法不限于任何特定的分離或純化過程。
可選擇地，用于制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物的引物可在5’端磷酸化，以便接下來使用lambda核酸外切酶去降解磷酸化的鏈，見Higuchiand Ochman(Nucleic Acids Research,17:5865(1989))，制備單鏈模板的其他可選方法也在本領(lǐng)域?yàn)槿藗兯绮粚?duì)稱PCR(Ausbel,etal.,“Current Protocols in Molecular Biology”)John Wiley&Sons,New York(1987)和固相捕獲(Holtman et al.,Nucleic AcidsResearch,17:4937-4946(1989))。
單鏈延伸產(chǎn)物典型地制備于至少含有一種修飾的核苷酸的反應(yīng)體系中，它們被引入延伸產(chǎn)物以使后者至少具有部分的抗3’→5’核酸外切酶活性的能力。這些修飾的核苷酸被引入后的主要功能就是去限制核酸外切酶對(duì)于3’雙脫氧核苷酶的3’→5’的外切活性。這些修飾的核苷酸為本領(lǐng)域所熟知，包括但不限于硫修飾的三磷酸脫氧核苷酸和硼修飾的三磷脫氧核苷酸(Eckstein and Gish,Trends in birchem,Sci.,14:97-100(1989)和Porter Nucleic Acids Research,25:1611-1617(1997))。
在制備了一系列不同長(zhǎng)度的單鏈延伸產(chǎn)物并選擇一種方法把它們與初始核酶分離之后，把這些單鏈延伸產(chǎn)物與參照核酸進(jìn)行雜交，參照核酸可以是一個(gè)特定基因的被典型地認(rèn)為是野生型的核酸或是該基因的一部分，其中包含結(jié)構(gòu)和調(diào)控區(qū)域。例如，參照核酸可以是一段被稱作基因座的核酸，它位于某一特定基因內(nèi)部或附近，當(dāng)它發(fā)生突變時(shí)，典型情況下會(huì)使個(gè)體產(chǎn)生改變的表現(xiàn)型或疾病。另外，突變也可以產(chǎn)生一種被認(rèn)為有利的不同的表現(xiàn)型，例如能夠解毒的細(xì)菌。任何突變通過這里所描述的方法檢測(cè)并深入研究，突變的特性不會(huì)限制這些方法的適用性。另外，參照核酸的分離、制備、合成或擴(kuò)增可以使用這里描述的方法也可使用本領(lǐng)域內(nèi)的其他方法，因?yàn)閰⒄蘸怂岬膩碓床幌抻谶@里所用的方法。
雜交的精確條件當(dāng)然將決定于參照核酸和初始核酸特定的序列，本領(lǐng)域的技術(shù)人員能容易地獲得特定的雜交條件。典型的優(yōu)化的雜交條件可以從很多種參考資料得到。例如，Innis et al(“PCRProtocols:A Guide to Methods and Applications”AcademicPress,Inc.1990)和Erlich,H.A.(PCR Technology,Principles andApplications for DNA Amplification)都說明了核酸擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)雜交條件。Sambrook et al.(“Molecular Cloning,a LaboratoryManual”Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))提出了典型核酸雜交的一般方法以及這些方法的優(yōu)化方案。任選地，單鏈延伸產(chǎn)物和參照核酸之間的特定雜交條件為保持可以剪切和替換單鏈延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的酶的活性，在典型情況下，酶活很高而且有高度的特異性。
在單鏈延伸產(chǎn)物和參照核酸雜交之后，一種可以剪切并替換單鏈延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的酶(也就是“校正”酶)被加入雜交反應(yīng)體系。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這一反應(yīng)可以在存在一種鏈終止核苷酸的條件下發(fā)生。如果3’末端核苷酸與參照核酸發(fā)生雜交，則這一3’末端核苷酸就會(huì)被替換以同一類型的鏈終止核苷酸(圖1)，當(dāng)延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸沒有與參照核酸雜交時(shí)，例如延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸代表著初始核酸在那個(gè)特定位置上的突變，校正酶將會(huì)去除延伸產(chǎn)物上的錯(cuò)配基并用一個(gè)可以檢測(cè)到的與參照核酸雜交的堿基替換。
這里描述的方法中所使用的特定的校正酶并不僅限于DNA聚合酶，而是包括任何酶或酶的組合，只要它們能夠去掉3’末端核苷酸并用另一個(gè)同樣或不同類型的核苷酸替換之。例如，校正酶可以是耐熱的聚合酶如VentDNA聚合酶，Deep VentDNA聚合酶，E.coli DNA聚合酶Ⅰ,Klenow片段DNA，聚合酶Ⅰ,T4 DNA聚合酶，T7 DNA聚合酶，UltimaDNA聚合酶和PfuDNA聚合酶。剪切3’末端核苷酸的酶可以是核酸外切酶，如E.coli核酸外切酶Ⅲ或者核酸外切酶Ⅰ結(jié)合一種聚合酶如T4 DNA聚合酶，可以有效地獲得同樣的結(jié)果。另外，這里描述的方法中還可以使用非校正的聚合酶。這種酶無法延伸錯(cuò)配的堿基，這一點(diǎn)為本領(lǐng)域所熟知并且是等位基因特異PCT和擴(kuò)增耐火突變系統(tǒng)(ARMS)的基礎(chǔ)，見Wu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:2757-2760(1989)和Newton et al.,Nucleic Acids Res.,17:2503-2516(1989)。
3’末端核苷酸無法與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物中混和的核苷酸可以包含這樣一種類型，它們與那些3’末端最初可與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸類型相同并且可被探測(cè)出來。例如，延伸反應(yīng)在相應(yīng)于dATP的鏈終止核苷酸存在的條件下進(jìn)行。發(fā)生在無法與參照核酸雜交的3’末端的核苷酸剪切/替換反應(yīng)使得3’末端與參照核酸可以雜交，且這一過程是存在放射性標(biāo)記的dGTP、dCTP和dTTP的條件下完成的，在這個(gè)例子中，放射性標(biāo)記的dGTP、dCTP和dTTP的任何一個(gè)被引入延伸產(chǎn)物，都會(huì)使其因放射性而被檢測(cè)出來。該反應(yīng)可以進(jìn)一步地包含一種內(nèi)部的對(duì)照，該反應(yīng)可以進(jìn)一步地包含一種內(nèi)部的對(duì)照，例如不同方法標(biāo)記的核苷酸，如35S-dATP或熒光dATP，這樣的標(biāo)記可以進(jìn)入那些在3’末端可與參照核酸苷相應(yīng)位置雜交的單鏈延伸產(chǎn)物，以便人們監(jiān)測(cè)反應(yīng)的活性，尤其在檢測(cè)到的突變很少或根本沒有的情況下，因?yàn)槟切?’末端可雜交的和不可雜交的延伸產(chǎn)物都可以被檢測(cè)出來并且區(qū)別開來?；蛘?，只讓標(biāo)記進(jìn)入那些在3’末端可以雜交的延伸產(chǎn)物中。
人們用于檢測(cè)突變存在的特定標(biāo)記當(dāng)然是可以變化的，例如，可以是放射性標(biāo)記，熒光標(biāo)記、發(fā)光標(biāo)記、可被檢測(cè)的與核苷酸相連的抗體、可被檢測(cè)與核苷酸相連的半抗原或者其他可被直接或間接檢測(cè)出的被修飾的核苷酸。因此用于檢測(cè)并區(qū)別3’末端可與參照核酸雜交和不可與之雜交的單鏈延伸產(chǎn)物的特定方法取決于這里描述的方法中所用的特定的標(biāo)記。例如，如果標(biāo)記的核苷酸是放射性的，檢測(cè)的方法應(yīng)該包括光計(jì)數(shù)或把反應(yīng)產(chǎn)物在底片上曝光，顯影后能夠區(qū)分標(biāo)記的核酸和未標(biāo)記的核酸。
本發(fā)明同時(shí)又提供了一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法，包括在存在修飾的核苷酸的條件下制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物中的修飾核苷酸可以抑制核酸外切酶對(duì)于3’末端堿基的活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，并使用一種酶處理，在存在選擇性修飾的核苷酸條件下，該酶可以切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸。這種被替換上去的選擇性修飾核苷酸不會(huì)再次替換而且可以抑制延伸產(chǎn)物的進(jìn)一步延伸，而以非修飾核苷酸為末端的延伸產(chǎn)物則可以進(jìn)一步地延伸，從而與那些不能繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來。去除沒有引入的選擇性修飾的核苷酸，延伸那些可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物，把可繼續(xù)延伸的和不可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，從而檢測(cè)初始核酸中的核苷酸變異。
這一特定方法基于校正聚合酶能夠在一種不可逆或“自殺”反應(yīng)中，用具有抗3’-5’核酸外切酶活性能力的修飾的鏈終止核苷酸去替換配對(duì)的末端鏈終止核苷酸，如雙脫氧核苷酸，由初始核酸而來的不同長(zhǎng)度的單鏈延伸產(chǎn)物與已知模板或參照核酸混合形成穩(wěn)定的雜交體。把它暴露于校正聚合酶或其類似的反應(yīng)中，在存在具有抗3’-5’核酸外切酶活性能力的鏈終止核苷酸條件下，如α-硫代-雙脫氧核苷酸，也就是延伸產(chǎn)物3’末端堿基的堿基類似物，把它們置于一定的條件下，該條件適于延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的切除及以用抗3’-5’核酸外切酶活性的鏈終止核苷酸替換(圖2)，如果延伸產(chǎn)物的3’末端與參照核酸的相應(yīng)位置雜交，則3’末端核苷酸會(huì)被切除并替換以具有抗進(jìn)一步3’-5’核酸外切酶活性的相應(yīng)的鏈終止核苷酸。校正聚合酶不再能夠校正3’末端核苷酸同時(shí)也不能延伸配對(duì)的末端堿基。然而如果單鏈延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸無法與參照核酸雜交的話(也就是在末端有錯(cuò)配堿基)，校正聚合酶將切除單鏈延伸產(chǎn)物的3’-末端核苷酸但不會(huì)在該位置添入鏈終止核苷酸，因?yàn)?，舉例來說，可以與參照核酸相應(yīng)位置雜交的鏈終止核苷酸在反應(yīng)混合物中不存在，這樣被校正的延伸產(chǎn)物能夠進(jìn)一步地延伸并被檢測(cè)出來，因此，3’-末端核苷酸與參照核酸相應(yīng)位置互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物將被不可逆地終止而3’-末端核苷酸與參照核酸相應(yīng)位置不互補(bǔ)的延伸產(chǎn)物會(huì)被校正然后作為引物進(jìn)行接下來的延伸反應(yīng)并被檢測(cè)出來。
為了接下來的延伸反應(yīng)，最好以反應(yīng)體系中去除抗3’-5’核酸外切酶活性的鏈終止核苷酶。這一點(diǎn)可以通過往反應(yīng)混和物中添加活性物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，該物質(zhì)可以使得抗3’-5’核酸外切酶活性的鏈終止核苷酶失去再次添加到單鏈延伸產(chǎn)物上去的能力，例如蝦堿性磷酸酶，它能水解鏈終止核苷酸的三磷酸，之后可對(duì)該酶進(jìn)行溫度滅活。另外，本領(lǐng)域中還有許多其他的方法可用于把模板和延伸產(chǎn)物從抗3’-5’核酸外切酶活性的鏈終止核苷酶中分離出來。例如，分子重量或大小分離，用以上討論的方法把延伸產(chǎn)物聯(lián)接到固體支持物上或是對(duì)游離核苷酸進(jìn)行選擇性的降解。
本方法中的引物延伸反應(yīng)可以通過引入標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，如上所述，或者間接地檢測(cè)，例如通過無機(jī)焦磷酸鹽的釋放，它是DNA合成過程中聚合酶介導(dǎo)的核苷合并的結(jié)果(Nyren,Anal.Biochem.,167:235-238(1987))，這一方案有利用反應(yīng)過程中對(duì)于聚合酶活性進(jìn)行連續(xù)的監(jiān)控。這一特定的反應(yīng)可以通過加入以下物質(zhì)進(jìn)行起始核苷三磷酸堿基，D-熒光素，L-熒光素，ATP硫酸化酶，蟲熒光素酶和一段寡核苷酸。該寡核苷酸與已知模板5’端區(qū)域或5’端附近的區(qū)域有著相同的序列并能夠啟動(dòng)延伸反應(yīng)。該寡核苷酸可通過反向啟動(dòng)任何制得的全長(zhǎng)延伸產(chǎn)物用來提高分析的靈敏度。這一點(diǎn)當(dāng)錯(cuò)配/突變發(fā)生在已知參照序列的近5’端時(shí)顯得尤為重要，因?yàn)樵诘竭_(dá)模板末端之前，加入的核苷酸相對(duì)較少。典型的照度計(jì)檢測(cè)，見Nyrenet al.(Anal Bochcm,244:367～373(1997))。使用耐熱蟲熒光素酶可以允許延伸反應(yīng)在較高的溫度進(jìn)行從而提高反應(yīng)的靈敏度和特異性(Kaliyama and Nakano,Biosci BiotechnolBiochom,58:1170～1171(1994))。
檢測(cè)多堿基引物延伸的方法的另一個(gè)實(shí)例是使用從PerkinElmer,Foster City,CA那里獲得的熒光5’核酸酶鑒定法，見Hollandet al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,7276～7280(1991)，這一方法涉及標(biāo)記探針，被稱為TaqMan探針，帶有一個(gè)報(bào)告分子和猝滅染料。該探針對(duì)于被擴(kuò)增的核酸的一段內(nèi)部序列具有特異性。隨著TaqDNA聚合酶延伸擴(kuò)增引物，它會(huì)遇到TaqMan探針并利用聚合酶的5’到3’核酸外切酶活性將其降解。報(bào)告分子同猝滅劑分離導(dǎo)致熒光的上升。應(yīng)用這種方法檢測(cè)多堿基延伸只需要合成與已知模板5’端序列互補(bǔ)的TaqMan探針、至于生物發(fā)光檢測(cè)，該方法允許連續(xù)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程中的聚合酶活性。它的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是高靈敏度和特異性，因?yàn)檫@一反應(yīng)可在提升的溫度下進(jìn)行。
這種方法的一種變體中，去除未被引入的修飾的核苷酸本身可被檢測(cè)則在檢測(cè)步驟之前延伸可以延伸的延伸產(chǎn)物這一步驟可以去掉。例如，當(dāng)3’末端堿基是一個(gè)猝滅核苷酸，去除該核苷酸可使核酸被檢測(cè)到，這樣延伸延伸產(chǎn)物并引入可檢測(cè)成分對(duì)檢測(cè)來說就不是必要的了。
另一種可選的檢測(cè)方法為往延伸產(chǎn)物中引入修飾的三磷酸脫氧核苷(dNTP)，實(shí)例包括放射性標(biāo)記、熒光標(biāo)記和半抗原標(biāo)記的dNTPs，例如，熒光標(biāo)記的dNTP允許直接的非放射性的檢測(cè)。和生物發(fā)光檢測(cè)一樣，這一方法的靈敏度可以通過使用一種寡核苷酸得到提高。該寡核苷酸可與已知模板的5’端區(qū)域或其附近區(qū)域發(fā)生雜交并且能夠啟動(dòng)從初始核酸的延伸反應(yīng)。和熒光5’核酸酶鑒定一樣，這一方法具有高靈敏度和特異性的優(yōu)點(diǎn)，因?yàn)檠由旆磻?yīng)能夠在提升的溫度下進(jìn)行，例如在一個(gè)溫度循環(huán)反應(yīng)中。這一方法可以增加一個(gè)額外的步驟用于去除任何沒有被引入的標(biāo)記，然后對(duì)引入的標(biāo)記進(jìn)行直接或間接的檢測(cè)。在一種實(shí)施方案中，可以用固相純化去捕獲純化延伸的寡聚體使之與所有未引入的熒光標(biāo)記的dNTPs分離，接著進(jìn)行熒光檢測(cè)。
還有另一種方法可以把那些3’-末端核苷酸可以與參照核酸相應(yīng)位置發(fā)生雜交的和不可以發(fā)生雜交的單鏈延伸產(chǎn)物區(qū)別開來。這一方法包括分離產(chǎn)物尋找全長(zhǎng)延伸產(chǎn)物，例如，可以通過變性凝膠電泳看見單鏈的包括全長(zhǎng)和非全長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物。全長(zhǎng)的延伸產(chǎn)物是由校正活動(dòng)替換3’末端核苷酸并進(jìn)一步延伸延伸產(chǎn)物而得到的。
本發(fā)明的一些應(yīng)用中，用于擴(kuò)增在總分析物中只占一小部分比例的突變是可取的，如在早期癌癥檢測(cè)中，在大量的被檢細(xì)胞中只存在很少的病變細(xì)胞，突變基因的選擇性擴(kuò)增，該突變發(fā)生在已知位點(diǎn)，如K-ras基因，可以通過設(shè)計(jì)特異的引物很容易地完成對(duì)突變的擴(kuò)增，見Stork et al(Oncogene,6:857～862(1991))。然而要想通過標(biāo)準(zhǔn)PCR方法在高比例的野生型基因中去選擇性地?cái)U(kuò)增一個(gè)基因的隨機(jī)突變是不可能的，在這些應(yīng)用中，選擇性地?cái)U(kuò)增突變模板也許很不錯(cuò)。因此，可以把來源于突變模板的延伸產(chǎn)物從已知的模板中純化出來與純化的從未知序列的樣品中擴(kuò)增得到的核酸進(jìn)行雜交。這些擴(kuò)增得到的核酸在與延伸產(chǎn)物混和之前需要純化去除殘留的引物以防止野生型模板的再次擴(kuò)增。雜交體可以與耐熱聚合酶還有dNTPs混合并置于適合延伸產(chǎn)物聚合的溫度循環(huán)條件下。那些因?yàn)?’末端錯(cuò)配而很難在已知模板上延伸的延伸產(chǎn)物現(xiàn)在可與產(chǎn)生它們的突變模板雜交并在聚合酶催化下進(jìn)行延伸，最好dNTPs中的一種已做了標(biāo)記，例如使用半抗原如地高辛配基可以對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行固相捕獲。之后使用最初目標(biāo)擴(kuò)增的引物進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增，優(yōu)迭擴(kuò)增含有突變的模板。然后，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)PCR產(chǎn)物序列進(jìn)行測(cè)序鑒定出突變或核苷酸變異的精確位置。
本發(fā)明又提供了一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酶變異的方法，包括在存在修飾核苷酸堿基和鏈終止核苷酸堿基的條件下產(chǎn)生一系列以初始核模為模板的延伸產(chǎn)物，把它們包含的修飾核苷酸可以抑制核酸外切酶對(duì)于3’末端核苷酸堿基的活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度，把它們與參照核酸雜交，之后在存在三磷酸脫氧核苷酶的條件下，用一種可以切除并替換延伸產(chǎn)物3’末端核苷酶的酶去處理雜交核酸。3’末端的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸不會(huì)被切除，因此如果在這一位置上為不能與參照核酸配對(duì)的核苷酸，它不能被替換掉，因此不能進(jìn)一步地延伸延伸那些可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物，把可以進(jìn)一步延伸和不可以進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來，從而檢測(cè)出初始核酸中的核苷酸變異。
這一特定的方法基于校正聚合酶無法剪切和/或延伸抗3’-5’核酸外切酶活性的錯(cuò)配的3’核苷酸，如硫-修飾核苷酸或硼-修飾核苷酸，在這一方法中，如上所述，制備一系列不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物，然后把這樣延伸產(chǎn)物與參照核酸雜交。之后把雜交體與校正酶以及所有四種脫氧核苷酸混和并置于適合校正和聚合的條件下，(圖3和4)。在那些3’末端核苷酸與已知參照核酸配對(duì)的單鏈延伸產(chǎn)物中，聚合酶切除鏈終止核苷酸或其他的3’-末端核苷酸然后替換該核苷酸并進(jìn)一步延伸該延伸產(chǎn)物。然而，如果在3’末端臨近處存在抗3’-5’核酸外切酶活性的修飾核苷酸的一個(gè)錯(cuò)配(也就是在3’末端核苷酸(圖3)或3’端倒數(shù)第二個(gè)核苷酸(圖4))，校正酶將不會(huì)剪切錯(cuò)配的末端或倒數(shù)第二個(gè)核苷酸并不會(huì)進(jìn)一步延伸延伸產(chǎn)物該反應(yīng)的產(chǎn)物可以用來分析，例如通過變性凝膠電泳。檢測(cè)出的那些沒有進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物表明在未知核酸和參照核酸之間有變異存在。檢測(cè)出的那些進(jìn)一步延伸的延伸產(chǎn)物表明模板在3’末端末端堿基互補(bǔ)，因此初始核酸的3’末端相對(duì)于參照核酸沒有變異存在。
由于末端堿基的類型對(duì)于該使用鏈終止核苷酸的方案并不重要，該末端堿基可在單鏈延伸產(chǎn)物與參照核苷酸雜交之前去除掉。幾種具有3’-5’活性的核酸外切酶適用于這一方案且很容易獲得，例如核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ。另外，切除末端堿基排除了接下來反應(yīng)中校正酶的需求。因此，缺乏3’-5’核酸外切酶活性的酶，如Bst DNA聚合酶的大片段和TaqDNA聚合酶，都可用于延伸檢測(cè)。
同時(shí)，因?yàn)?’末端核苷酶僅僅作為聚合酶延伸活性的合適的底物，可使用其他一些序列方法制備一系列不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物用于該檢測(cè)方法，例如，使用硫代磷酸化或硼磷酸化的修飾核苷酸作為引物延伸反應(yīng)中的定界符，接著用核酸外切酶Ⅲ進(jìn)行酶解(見Labeit etal.,DNA,5:173(1986)and Porter,Nucleic Acids Research25:1611～1617(1997))。通過這些方法所制備的一系列長(zhǎng)度不同的單鏈延伸產(chǎn)物可以以硫-或硼-修飾核苷酸作為末端并且非常適合于這一方法。
以下的實(shí)例是為了為本領(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)員提供所要求方法的完整的說明和描述，這些實(shí)例純粹只是用于解釋本發(fā)明，而不是為了限制發(fā)明者所認(rèn)為的發(fā)明的范圍。我們力圖保證數(shù)字的準(zhǔn)確(如，數(shù)量、溫度等)，但難免還會(huì)出現(xiàn)一些錯(cuò)誤和誤差。除非特別指出，否則份數(shù)為重量份，溫度單位為℃，壓強(qiáng)為大氣壓或接近大氣壓。
實(shí)施例模板分子的制備K-ras的擴(kuò)增、K-ras基因外顯子1的275堿基對(duì)區(qū)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)得到擴(kuò)增。該反應(yīng)使用的引物為K-ras p-A(p-CAGAGAAACCTTTATCTG)(SEQ ID No:1)它包含一個(gè)5’磷酸和K-ras B(GTACTGGTGGAGTATTT)(SEQ ID No:2)參見Stork etal.Oncogene,6:857～862(1991)。所有引物都是通過OligosEtc.,Inc.,Wilsonyille,OR.合成。反應(yīng)體系(20μl)包括10mMTris-Hol,pH8.3,50mM KCl,2.0,mM MgCl2,1pm/μl Kras A&B引物，200μM的每一種dNTP,1ng/μl K562基因組DNA(Promega,Madison,WI)和0.025units/μl的TaqDNA聚合酶(Perkin Elmer,FosterCity,CA)。根據(jù)制造商的說明，在使用之前，Taq聚合酶與Taq Start抗體(Clontech,Palo Alto CA)相混和，溫度循環(huán)使用Gene Amp 9600PCR系統(tǒng)(Perkin Elmer)。并使用以下程序保持95℃5分鐘，循環(huán)95℃15秒，53℃30秒，72℃15秒共33個(gè)循環(huán)，保持72℃5分鐘。
序列確定。擴(kuò)增得到的DNA用izard PCR Preps DNAPurification System(Promega)以便循環(huán)測(cè)序，測(cè)序沿所有兩個(gè)方面使用引物K-rasA或K-rasB。循環(huán)測(cè)序和檢測(cè)依照制造商說明使用Silver Sequence DNA Sequencing System(Promega)完成。循環(huán)條件為保持95℃5分鐘，循環(huán)95℃30秒，50℃30秒，72℃60秒共60個(gè)循環(huán)，保持4℃永久，序列依照GenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的BLAST分析(Altschulet al.,J.Mol.Biol.215:403-10(1990))被確定為野生型即細(xì)胞c-ki-ras2的癌基因外顯子1的正常序列。
單鏈模板的制備。使用lambda核酸外切酶(Higuchi andOchman,Nucleic Acids Research,17:5865(1989))把純化的PCR產(chǎn)物消化成單鏈。使用的是Pharmacia Biotech,Inc.,Piscataway,NJ的PCT Template Preparation Kit。
制備雙脫氧終止的寡聚體擴(kuò)增和測(cè)序。從細(xì)胞系SW480(American Type CultureCollection,Rockville,MD)的基因組中擴(kuò)增出K-ras基因的相同區(qū)域并用以上所述的方法純化，純化得到的模板(40ng)在10μl 0.7×Sequenase Reaction Buffer(Amersham)中與10pm的K-rasA引物混合，加熱至100℃保持2分鐘立即冰水浴5分鐘，往冰冷的DNA混合物中加入5μm Enzyme Mix[1μl0.1MPTT(Amersham)+2μl的5×sequence Buffer(Amersham)+2μl的Sequence Version 2.0(Amersham)按1∶8稀釋于Enzyme Dilution Buffer(Amersham)]。這一混和物(3.5μl)轉(zhuǎn)到一支37℃的試管中它包含2.5μl 200μM的每一種α-硫代-dNTP(Amersham)和1μM的ddATP(Pharmacia)。類似地，對(duì)另外三種ddNTPs進(jìn)行重復(fù)，把樣品在37℃下反應(yīng)5分鐘，在每支試管中加入30μl的1×TE pH7.5(10mM Tris-Cl pH7.5,1mMEDTA)停止反應(yīng)。
純化模板的延伸產(chǎn)物。使用鏈霉親和素包裹的磁珠(DynabeadsM-280,Dynal Inc.,Lake Success,NY)對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行固相捕獲，在使用之前，根據(jù)制造商的說明，Dynabead要用2×B&W buffer(10mMtris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,2M NaCl)進(jìn)行沖洗，對(duì)于每一個(gè)完成的雙脫氧測(cè)序反應(yīng)，需要加入40μl處于2×B&W緩沖液中的1.25μg/μl的鏈霉親和素包裹磁珠在室溫下反應(yīng)15分鐘，中間間斷地旋振，之后用40μl的2×B&W緩沖液沖洗磁珠，根據(jù)制造商的說明熔解DNA雙鏈?zhǔn)怪怄湣?br> 從突變體和野生型模板制備α-硫代終止的寡聚體。從K562和SW480(Americarn Type Culture Collection,Rockville,MD)這兩種細(xì)胞系中擴(kuò)增得到K-ras基因的相同區(qū)域，純化的模板(240ng)在60μl 0.07×Sequenase Reaction Buffer中與60pm的K-ras b-A引物混和。20μl等體積分裝、加熱到100℃，保持3分鐘然后立即在冰浴中冷卻5分鐘，往冰冷的DNA混合物中加入10μl EnzymeMix(1μl的0.1M DTT+2μl的5×Sequenase Buffer+2μl的Sequenase Version 2.0以1∶8稀釋于Enzyme Dilution Buffer)這一混合物(28μl)加到一支37℃的試管中，該試管中含有20μl 26μM的α-硫代-dATP,80μM的其余三種dNTPs，把樣品在37℃反應(yīng)5分鐘之后加熱至75℃保持10分鐘使反應(yīng)失活，往每一個(gè)失活的延伸反應(yīng)中加入16μl含20U/μl核酸外切酶Ⅲ(Promega)的溶液，該反應(yīng)在37℃反應(yīng)30分鐘然后加熱到70℃保持10分鐘進(jìn)行熱失活。
核苷酸變異的延伸檢測(cè)非延伸檢測(cè)。為SW480和K562α-硫代終止寡聚體設(shè)置2個(gè)雜交反應(yīng)，一個(gè)包含來源于K562的單鏈K-ras模板DNA，一個(gè)沒有模板DNA。含有雜交反應(yīng)的模板包含以下的成分來自K562或SW480的36μlα-硫代終止寡物，100ng來源于K562的單鏈K-ras模板，60μl 2×B&W緩沖液(10mM Tris-HCl,pH7.5,1.0mM EDTA,2M NaCl)和分子生物學(xué)等級(jí)(MBG)的水(Sigma W-4502,St.Louis.MO)至終體積120μl。又設(shè)置一個(gè)沒有模板的平行反應(yīng)。反應(yīng)加熱至99℃保持2分鐘，然后以每分鐘1℃的速度冷卻到58℃，反應(yīng)物轉(zhuǎn)移至MicroconYM-30離心過濾裝置在7200×g下離心5分鐘保留物與450μlMBG水混和并濃縮2次，保留物用MBG水調(diào)節(jié)到12μl的終濃度，把6μl保留物與4μl延伸主要混合物25mM Tris-HCl,pH8.3,125mM Kcl.510mMMgCl2,500μM的每一種dNTP和0.125units/μl的TaqNDA聚合酶(Perkin Elmer)在使用Taq聚合酶之前，根據(jù)制造商說明，要把它與Taq Start抗體(clontech,Palo Alto,CA)混合，反應(yīng)按以下溫度循環(huán)進(jìn)行保持95℃5分鐘，循環(huán)95℃15秒接著94℃15秒接下來的14個(gè)循環(huán)每次降低2℃，循環(huán)95℃15秒，68℃15秒并每次降低2℃,72℃15秒共19個(gè)循環(huán)，完成后，往每個(gè)反應(yīng)中加入4μl反應(yīng)終止溶液(95％甲酰胺20mM EDTA,0.05％溴汾藍(lán)，0.05％二甲苯胺FF)，加樣3μl上清到0.04mm×20cm×34cm 6％的變性聚丙烯酰胺凝膠作分析，加樣之前凝膠在40W預(yù)熱30分鐘，40W下跑50分鐘，根據(jù)制造商說明使用Phototope-Star Dctection Kit(New England Biolabs)對(duì)延伸產(chǎn)物進(jìn)行化學(xué)發(fā)生檢測(cè)。
單堿基延伸檢測(cè)。6μl單堿基延伸主要混合物包含1×ThermoPol Reaction Buffer(New England Biolabs,Inc.Beverly,MA),2.0mM MgSO4,200μM一種與末端雙脫氧核苷酸配對(duì)的非標(biāo)記dd NTP,200μM用33P(Amersham)標(biāo)記的其余三種ddNTPs,1ng/μl的單鏈模板DNA和0.01units/μl的Vent DNA聚合酶(New EnglandBiolabs Inc.)用于懸浮延伸產(chǎn)物的固相。溫度循環(huán)如下保持95℃5分鐘，循環(huán)95℃15秒，然后94℃15秒，接下來的14個(gè)循環(huán)每次降低2℃，循環(huán)95℃15秒。68℃15秒并每次降低2℃,72℃15秒共計(jì)19個(gè)循環(huán)，保持4℃。
貫穿本申請(qǐng)，參考了不同的出版物，作為參考引入本申請(qǐng)的出版物完整地引入是為了更好地說明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的情況。
雖然本發(fā)明參照某方案的特定細(xì)節(jié)進(jìn)行描述，并不意味著這些細(xì)節(jié)是對(duì)本發(fā)明范圍和對(duì)它們包含于附加權(quán)利要求的程度的一種限制。
序列表<110>Dahlhauser,Paul<120>篩選核酸尋找核苷酸變異的方法<130>07036.0001/P<150>09/137,075<151>1998-08-20<160>2<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<221>寡聚核苷酸，單鏈<223>擴(kuò)增引物<400>1cagagaaacc tttatctg 18<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<221>寡聚核苷酸，單鏈<223>人工引物<400>2gtactggtgg agtattt 1權(quán)利要求
1．一種在初始核酸中探測(cè)核苷酸變異的方法，包括a)在存在修飾核苷酸的條件下，產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的單鏈延伸產(chǎn)物，其中這些延伸產(chǎn)物摻入了修飾的核苷酸并借此限制核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基的外切活性，其中這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度；b)把這些不同長(zhǎng)度的單鏈延伸產(chǎn)物與參照核酸雜交；c)在存在選擇性標(biāo)記的核苷酸的條件下，使用一種酶作用于雜交的核酸，該酶可切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酶，其中，那些3’末端無法與參照核酸相應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物被替換以一個(gè)可與參照核酸雜交的核苷酸，這樣就可以把在3’末端可與參照雜交的和不可與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來；d)區(qū)別那些3’末端不雜交的和3’末端雜交的延伸產(chǎn)物，借此檢測(cè)初始核酸中的核苷酸變異。
2．權(quán)利要求1的方法，其中修飾的核苷酸包括硫修飾脫氧核苷酸。
3．權(quán)利要求1的方法，其中修飾的核苷酸包括硼修飾的脫氧核苷酸。
4．權(quán)利要求1的方法，其中切除和替換延伸產(chǎn)物3’末端的酶包括一種校正聚合酶。
5．權(quán)利要求1的方法，其中延伸產(chǎn)物被修飾。
6．權(quán)利要求5的方法，其中修飾包括把生物素連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
7．權(quán)利要求5的方法，其中修飾包括把半抗原連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
8．權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括通過把它們吸附到固相支持物上而分離步驟(a)的延伸產(chǎn)物。
9．權(quán)利要求6的方法，其中延伸產(chǎn)物用生物素標(biāo)記并把它們吸附到包裹有鏈霉親和素的固相支持物上進(jìn)行分離。
10．權(quán)利要求1的方法，其中步驟(c)進(jìn)一步包括在存在標(biāo)記的核苷酸堿基的條件下進(jìn)行反應(yīng)，該標(biāo)記以二次標(biāo)記的標(biāo)記的三磷酸雙脫氧核苷形式存在，借此作為酶發(fā)生作用的陰性對(duì)照。
11．權(quán)利要求1的方法，其中延伸產(chǎn)物因引入鏈終止核苷酸而具有不同的長(zhǎng)度。
12．權(quán)利要求1的方法，其中延伸產(chǎn)物通過其部分核酸外切酶消化而且有不同的長(zhǎng)度。
13．一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酶變異的方法包括a)在存在修飾核苷酸的條件下，產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的延伸產(chǎn)物，這些延伸產(chǎn)物摻入了修飾的核苷酸并借此限制了核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基的外切活性，這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度；b)把這些長(zhǎng)度不同的延伸產(chǎn)物與參照核酸雜交；c)用一種酶處理雜交核酸，在存在選擇性修飾核苷酸時(shí)，該酶能切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，因這種選擇性修飾核苷酸抗進(jìn)一步替換，當(dāng)它引入延伸產(chǎn)物時(shí)可以抑制延伸產(chǎn)物的進(jìn)一步延伸，而以非修飾核苷酸為末端的延伸產(chǎn)物則可進(jìn)一步延伸，借此與不能繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來；d)去除未引入的選擇性修飾核苷酸；e)延伸可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物；f)區(qū)別可繼續(xù)延伸的和不可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物，借此檢測(cè)初始核酸中的核苷酸變異。
14．權(quán)利要求13的方法，其中選擇性修飾核苷酸包括硫-修飾的三磷酸雙脫氧核苷酸。
15．權(quán)利要求13的方法，其中選擇性修飾核苷酸包括硼-修飾的三磷酸雙脫氧核苷酸。
16．權(quán)利要求13的方法，其中步驟(d)進(jìn)一步包括加入蝦堿磷酸酶并置于適合該酶活性的條件下，然后使該酶失活。
17．權(quán)利要求13的方法，其中去除和替換延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的酶包括一種校正聚合酶。
18．權(quán)利要求13的方法，其中延伸產(chǎn)物被修飾。
19．權(quán)利要求18的方法，其中修飾包括把生物素連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
20．權(quán)利要求18的方法，其中修飾包括把半抗原連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
21．權(quán)利要求13的方法，進(jìn)一步包括通過吸附于固相支持物分離步驟(a)的延伸產(chǎn)物。
22．權(quán)利要求19的方法，其中延伸產(chǎn)物用生物素標(biāo)記，并把它們吸附于包裹有鏈霉親和素的固相支持物上進(jìn)行分離。
23．權(quán)利要求13的方法，其中通過引入鏈終止核苷酸產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物。
24．權(quán)利要求13的方法，其中通過延伸產(chǎn)物部分核酸外切酶消化產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物。
25．一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法包括a)在存在修飾核苷酸堿基和鏈終止核苷酸堿基的條件下，以初始核酸為模板制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物，其中延伸產(chǎn)物中引入的修飾核苷酸限制了核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基的外切作用，這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度；b)把這些不同長(zhǎng)度的延伸產(chǎn)物與參照核酸雜交；c)用一種酶去處理雜交核酸，在存在三磷酸脫氧核苷酸的條件下，用該酶去除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸，3’端的倒數(shù)第二個(gè)核苷酸不會(huì)被切除，因此，那些3’端倒數(shù)第二個(gè)核苷酸無法與參照核酸相應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物不會(huì)被替換以可與之雜交的核苷酸，因此不能繼續(xù)延伸；d)延伸那些可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物；e)區(qū)分可繼續(xù)延伸的和不可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè)初始核酶中的核苷酸變異。
26．權(quán)利要求25的方法，其中單鏈延伸產(chǎn)物用可檢測(cè)的標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，區(qū)分步驟(e)包括對(duì)步驟(d)的反應(yīng)物進(jìn)行凝膠電泳，其中電泳有足夠的分辨率來區(qū)別沒有繼續(xù)延伸的標(biāo)記的延伸產(chǎn)物和進(jìn)一步延伸的標(biāo)記的延伸產(chǎn)物。
27．權(quán)利要求25的方法，其中修飾的核苷酸包括硫修飾脫氧核苷酸。
28．權(quán)利要求25的方法，其中修飾核苷酸包括硼-修飾的脫氧核苷酸。
29．權(quán)利要求25的方法，其中去掉并替換延伸產(chǎn)物3’末端核苷酸的酶包括一種校正聚合酶。
30．權(quán)利要求25的方法，其中延伸產(chǎn)物被修飾。
31．權(quán)利要求30的方法，其中修飾包括把生物素連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
32．權(quán)利要求30的方法，其中修飾包括把半抗原連結(jié)到延伸產(chǎn)物上。
33．權(quán)利要求25的方法，進(jìn)一步包括通過吸附于固相支持物上而分離步驟(a)的延伸產(chǎn)物。
34．權(quán)利要求25的方法，其中延伸產(chǎn)物用生物素標(biāo)記并通過把它們吸附于包裹有鏈霉親和素的固相支持物進(jìn)行分離。
35．一種在初始核酸中檢測(cè)核苷酸變異的方法，包括a)在存在修飾核苷酸堿基的條件下以初始核酸為模板制備一系列單鏈延伸產(chǎn)物，延伸產(chǎn)物引入了抑制核酸外切酶對(duì)3’末端核苷酸堿基外切活性的修飾的核苷酸堿基，這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度；b)把這些長(zhǎng)度不同的延伸產(chǎn)物與參照核酸雜交；c)在存在三磷酸脫氧核苷酸的條件下，用一種酶處理雜交核酸，該酶可以進(jìn)一步延伸那些3’末端可與參照核酸相應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物，而那些3’末端未與參照核酸相應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物則不能繼續(xù)延伸；d)延伸那些可繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物；e)區(qū)別那繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物和沒有繼續(xù)延伸的延伸產(chǎn)物，從而檢測(cè)出初始核酸中的核苷酸變異。
36．權(quán)利要求35的方法，其中延伸產(chǎn)物通過部分的核酸外切酶消化而產(chǎn)生不同的長(zhǎng)度。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種方法用于在初始核酸中探測(cè)核苷酸變異,包括在存在修飾核苷酸的條件下產(chǎn)生一系列以初始核酸為模板的單鏈延伸產(chǎn)物。這些延伸產(chǎn)物中含有修飾的核苷酸并借此抑制核酸外切酶對(duì)于3’末端核苷酸堿基的活性。這些延伸產(chǎn)物有著不同的長(zhǎng)度,把它們與參照核酸雜交,并使用一種酶作用于雜交的核酸。當(dāng)存在選擇性標(biāo)記核苷酸的條件下,可用該酶切除并替換延伸產(chǎn)物的3’末端核苷酸。這樣,那些在3’末端處無法與參照核酸對(duì)應(yīng)位置雜交的延伸產(chǎn)物在相應(yīng)的位置被替換以一個(gè)或多個(gè)可以與參照核酸雜交的核苷酸,這樣就可以把在3’末端可與參照核酸雜交的和不可與參照核酸雜交的延伸產(chǎn)物區(qū)別開來,并由此探測(cè)初始核酸的核苷酸變異。本發(fā)明還提供了這一方法的變型,利用它可以探測(cè)出單鏈延伸產(chǎn)物3’端倒數(shù)第二個(gè)堿基的突變。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1324410SQ99812395
公開日2001年11月28日 申請(qǐng)日期1999年8月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月20日
發(fā)明者P·A·達(dá)爾豪澤 申請(qǐng)人:遺傳檢測(cè)公司