專利名稱：用于抽血的容器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于抽血的容器，抽取的血液應(yīng)該特別用于穩(wěn)定和分析核酸。
當(dāng)抽取血液時，通常收集在已經(jīng)含有抗凝劑例如肝素，檸檬酸鹽或EDTA的容器中。從而防止血液凝結(jié)。這樣獲得的血液樣品可以在合適的溫度下貯存很長時間。但是當(dāng)要分析核酸例如(m)RNA或DNA時，這種獲得血液的方法具有很大的缺陷。為了這樣的目的，應(yīng)該在抽取時就已經(jīng)最適當(dāng)?shù)貙悠分泻械暮怂岱€(wěn)定化了，就是即應(yīng)該防止存在的核酸的降解也要防止新的mRNA的合成。
實際上還沒有實現(xiàn)自抽取時樣品材料中含有的核酸的穩(wěn)定貯存目的是由于下面的原因細胞含有核酸酶，酶，它們一旦接觸它們的底物就破壞核酸(RNA,DNA)。只要細胞處于它們正常的環(huán)境中，則細胞和細胞外核酸酶一般處于生理調(diào)控下。抽取血液更強或更弱地影響細胞中含有的核酸的變化。然后細胞內(nèi)釋放核酸酶和/或通過細胞裂解至胞外。此外，更強或更弱地合成核酸。特別是血液的長期貯存導(dǎo)致細胞的老化和破壞。
根據(jù)標準抽血方法獲得的血液樣品長期貯存產(chǎn)生的另一個問題是樣品材料的相當(dāng)大的變化。這樣的變化，例如細胞的強烈裂解，可能具有一定作用使得分離核酸的標準方法在足夠地有效的方法中不再有效。
除了有關(guān)樣品材料中含有的核酸的穩(wěn)定貯存的問題外，抽血的常規(guī)方法中還有其它困難。在分離核酸期間，常規(guī)的抗凝劑通常不會足夠有效地被分離并且干擾下面的核酸分析，例如在利用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))的擴增的情況下。例如肝素是一種普遍公知的PCR的抑制劑。
最后，核酸定量分析產(chǎn)生的問題，即從取樣至核酸的測定的全部方法怎樣在標準化條件下可以控制。理想的是，定性和定量確定的標準核酸應(yīng)該在抽取期間就已經(jīng)被加入到樣品材料中了并且應(yīng)該使進行取樣和測定的整個過程。這也可以使用常規(guī)抽取系統(tǒng)來完成。
常規(guī)抽血的另一個缺陷是有轉(zhuǎn)移感染材料的危險，因為迄今為止分離核酸需要人工處理步驟。不能排除與潛在的感染病菌接觸。
在文獻中描述了一種方法，其中血液樣品在從患者抽取后直接與胍鎓鹽混合(EP0818542A1)。在該方法中，胍鎓鹽以粉末形式存在從而發(fā)揮胍鎓鹽的增強的穩(wěn)定性。但是該方法具有嚴重的缺陷，因為該鹽例如必須首先溶解于加入的血液中。該溶解方法特別取決于溫度并且因為使用了不透明的樣品材料而不能控制。因此用于診斷醫(yī)學(xué)目的的相應(yīng)的產(chǎn)物的使用是非常有問題的。
此外，核酸酶是極具活性的酶，其只有在極端變性條件下才可能被抑制。變性取決于溶液中胍鎓鹽的濃度。溶液中胍鎓鹽的抑制濃度在一開始引述的方法中并不存在。因此，在溶解過程中存在不可控制的核酸的降解。此外，在該方法中省去了加入還原劑，沒有還原劑不會保證有效的抑制作用，特別是RNA酶的抑制作用(參見實施例5)。
此外，用這種方法制備的樣品不能直接用于在玻璃表面上進一步的核酸分離。此外，胍鎓鹽粉末的使用不允許加入核酸內(nèi)標物。這樣的標準物對于工藝控制和精確定量分析是必須的。
本發(fā)明以提供不具有現(xiàn)有技術(shù)缺陷的抽血用容器的技術(shù)問題為基礎(chǔ)。特別地，可以使用該容器取出的樣品直接進行用于分析核酸的標準方法而不需要進一步的樣品制備步驟。
根據(jù)本發(fā)明，通過用于抽血的容器解決該問題，所述容器含有包括下面成分的水溶液-胍鎓鹽(guanidinium salt)；-緩沖物質(zhì)；-還原劑；和/或-去污劑。
本發(fā)明的容器具有下面的優(yōu)點1．在抽取時血液已經(jīng)溶解，抽血容器中已經(jīng)含有在溶液中的穩(wěn)定核酸的物質(zhì)。2．該穩(wěn)定核酸的物質(zhì)的組成使得樣品材料特別是其中含有的核酸在接觸該溶液時直接被穩(wěn)定化。3．與所有的以前的標準抽血系統(tǒng)例如含有EDTA或肝素的抽血系統(tǒng)相反，經(jīng)穩(wěn)定的樣品不再需要當(dāng)作傳染性材料來處理。4．該穩(wěn)定核酸的物質(zhì)的組成使得樣品材料可以直接在下面的分離方法中使用。5．在下面的分離中可以如此有效地分離該穩(wěn)定核酸的物質(zhì)使得沒有發(fā)現(xiàn)PCR的抑制作用。6．可以將內(nèi)標物加入該穩(wěn)定核酸的物質(zhì)。這允許從取樣開始至檢測核酸時止控制整個方法。
第1項中提到的抽血容器是常規(guī)的抽血容器(小試管)，其中加入了一定體積的穩(wěn)定核酸的物質(zhì)。然后優(yōu)選地將該小試管設(shè)定一定的真空度，這保證只有特定體積的血液可以在抽血期間流入其中?？梢酝ㄟ^常規(guī)的取血方法控制小試管。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，該試管中含有的溶液含有下面的試劑硫氰酸胍，Triton-X-100，二硫蘇糖醇和合適的緩沖系統(tǒng)，例如檸檬酸鹽，Tris或HEPES。在描述的組合物中，該溶液與真空試管可相容。該溶液可以貯存在該真空試管中沒有任何問題并且沒有任何期望的穩(wěn)定功能的破壞。整個系統(tǒng)不存在問題，特別是對于供血者不存在問題，并且在取樣期間是安全的。
含有胍鎓鹽，緩沖物質(zhì)，還原劑和/或去污劑的溶液在貯存時是穩(wěn)定的并且將供應(yīng)的剛抽取的血液轉(zhuǎn)化為在貯存時也穩(wěn)定的物質(zhì)并且可以直接用于標準核酸分析試劑盒(例如Roche或Qiagen的那些試劑盒)。
硫氰酸胍和/或氯化胍優(yōu)選作為胍鎓鹽。
優(yōu)選地，胍鎓鹽以2.0至8.0M的濃度存在。Tris或檸檬酸鹽優(yōu)選作為緩沖物質(zhì)，優(yōu)選用HCl調(diào)節(jié)精確的pH。然而，其它可能的緩沖液是HEPES,MOPS，檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液，例如PBS。
緩沖液濃度優(yōu)選在10和300mM之間，特別優(yōu)選在10和100mM之間。
Triton-X-100優(yōu)選作為去污劑。其它可能的去污劑是NP-40,Tween 20,polydocanol或者其它去污劑。
去污劑濃度優(yōu)選是5-30％(w/v)，特別優(yōu)選是10-20％(w/v)。
DTT優(yōu)選作為還原劑，但是也可以使用β-巰基乙醇，TCEP(三(2-羧乙基)膦)或者其它還原劑。
還原劑優(yōu)選的濃度是0.1-10％(w/v)，特別優(yōu)選是0.5-2％(w/v)。
溶液的pH優(yōu)選是3.0-9.0，特別優(yōu)選是4.0-7.5，特別優(yōu)選是5-6。
特別選擇溶液的pH使得在加入樣品材料后pH范圍是5.0-7.6。特別優(yōu)選的是6.3-6.9之間的pH(參見實施例8)。
特別優(yōu)選的溶液優(yōu)選含有4M硫氰酸胍，45mM Tris/HCl,18％，優(yōu)選15％(w/v)Triton-X-100,0.8％(w/v)DTT并且具有6.0的pH。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，接收血液樣品的體積具有負壓，其可以被調(diào)節(jié)使得將先前確定的血液體積在血液容器被穿孔后吸到容器中。相應(yīng)地，真空的容器在市場上是可購得的。
然后可以使含有抽取的血液的容器立刻進行進一步的分析，或者，可以貯存很長時間(多達幾天)而沒有任何樣品品質(zhì)的不利因素。
在本發(fā)明的方法中，新采取的血液在抽血容器中直接與上述溶液接觸使得立刻終止可能改變樣品的核酸模式的所有過程。因此，在稍后時間測定的關(guān)于測定的核酸的數(shù)據(jù)非常精確地代表抽血時的實際狀態(tài)，即關(guān)于核酸的量和類型兩者。
優(yōu)選地，采取的血液的量是加入到容器中的溶液的0.1-4倍。所述溶液優(yōu)選是0.5-5.0ml。因此，加入血液后胍鎓鹽的終濃度是1.0-5M，優(yōu)選是1-3M，特別優(yōu)選是2-3M(參見實施例7)。
根據(jù)本發(fā)明的容器優(yōu)選用于當(dāng)血液樣品要用來分析核酸時的血液抽取。
上述溶液作為描述的抽血系統(tǒng)的成分的用途只是保證細胞的立刻溶解，同時通過立刻滅火核酸酶而穩(wěn)定樣品。令人驚奇的是，這樣獲得的血液樣品甚至在室溫下或者更高溫度下也可以貯存幾天。此外，該抽血系統(tǒng)保證在通過核酸分離至分析的樣品處理中沒有污染和非傳染性處理。在常規(guī)的核酸分離方法中，目前還要求另外的處理步驟(例如將采取的血液樣品轉(zhuǎn)移到用于核酸分離的試劑中等等)，這必然伴有另外的感染的危險。
用該抽血系統(tǒng)獲得的樣品與所有的常規(guī)標準核酸分離方法相匹配。這里應(yīng)該特別注意以核酸結(jié)合玻璃表面為基礎(chǔ)的方法，以及特定序列與互補核酸結(jié)合和以溶劑為基礎(chǔ)的提取方法。
因此，描述的本發(fā)明包括一種抽血系統(tǒng)，表達其滿足下面的條件。1．控制取樣并且同時穩(wěn)定樣品材料中含有的核酸(DNA,RNA)。2．取樣，其中可以完全省略使用抗凝劑。3．利用上述抽血系統(tǒng)獲得的樣品可以用于所有的用于分離核酸的公知的系統(tǒng)中的通用的方式。4．該抽血系統(tǒng)在貯存中是穩(wěn)定的。
另外，出人意料地發(fā)現(xiàn)利用描述的抽血系統(tǒng)獲得的樣品可以在容器中貯存很長時間而沒有核酸的降解(參見實施例2,3,7,8)。
下面的實施例將解釋本發(fā)明實施例1在優(yōu)選的實施方案中，所述抽血系統(tǒng)可以包括如下(見圖1)裝有一定體積的穩(wěn)定核酸的物質(zhì)的小試管，并且提供有一定的真空度，并且用隔膜密封。制備該隔膜使得其與標準的取樣附件(插管等)相匹配。在本實施例中提供2.2ml試劑，調(diào)節(jié)真空度使得精確地2.2ml血液可以在取樣期間流入。流動的血液中含有的核酸立刻轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定形式。
關(guān)于下面的實施例的一般的初步說明。
在下面描述的所有的實施例中，除非另有說明，穩(wěn)定核酸的物質(zhì)(N-sS)具有下面的成分45mM Tris,5M硫氰酸胍(GTC),0.8％(w/v)二硫蘇糖醇(DTT),18％(w/v)Triton-X-100,pH6.0。
在描述的所有的實施例中，除非另有說明，所述穩(wěn)定核酸的物質(zhì)與樣品以1∶1的比例(1體積N-sS加1體積樣品材料)混合。低濃度的N-sS，例如1體積N-sS加5體積樣品，可以影響RNA的降解。
對于所有的實施例，通過在抽血時直接將血液加入混合有N-sS的小試管中來穩(wěn)定血液。
實施例2混合樣品材料和N-sS后核酸的穩(wěn)定性。用二氧化硅衍生化表面從樣品裂解物中分離RNA和DNA。
材料和方法抽血后直接使用，4℃下貯存6天后使用，和-20℃下貯存1個月后使用用于DNA和RNA分離的樣品材料。
使用高純度RNA分離試劑盒(BoehringerMannheim,cat.no.1828665)來分離RNA(圖2)。如下改變包裝散頁中給出的說明書以600微升一份分4等份向柱子加入2.4ml體積的樣品裂解物，使得總共提供2.4ml裂解物的樣品材料。所有其它步驟根據(jù)包裝散頁進行。最后用100微升洗脫緩沖液洗脫RNA。
對于分離DNA(圖3)，使用了QiaAmp Blood Kit(Qiagencat.no.29104)。在幾點上改變了包裝散頁中描述的標準程序?qū)?00微升樣品直接加給柱子；沒有使用試劑盒中含有的結(jié)合試劑。加入25微升蛋白酶-K母液，并且該樣品在室溫下溫育10分鐘。接著，將該柱子放到收集容器中并且根據(jù)包裝散頁所述離心。所有其它步驟根據(jù)包裝散頁進行，除了使用乙醇。洗脫體積是200微升。
實施例3使用包被鏈霉抗生物素的磁性顆粒和生物素標記的寡脫氧胸苷酸(Oligocdt)從樣品裂解物分離mRNA(圖4)材料和方法向容器中加入20ml樣品裂解物。根據(jù)下面的方法分離mRNA首先向裂解物加入30ml雜交緩沖液(20mM Tris-HCl,300mM NaCl,6nM生物素標記的寡脫氧胸苷酸，pH7.4)。然后加入3mg鏈霉抗生物素磁性顆粒(Boehringer Mannheim)?；旌显摌悠凡⑶以谑覝叵聹赜?分鐘。借助于磁體分離磁性顆粒；棄除上清液。然后將顆粒再懸浮于洗滌緩沖液1(10mM Tris-HCl,200mM NaCl,1％Triton-X-100,pH7.5)并且用洗滌緩沖液2(10mM Tris-HCl,200mM NaCl,pH7.5)洗滌三次(洗滌步驟再懸浮，磁性分離，去除上清液)。最后洗滌步驟之后完全去除上清液，并且顆粒再懸浮于20微升蒸餾水中。樣品被加熱到70℃維持5分鐘。分離磁性顆粒，利用凝膠電泳分析含有mRNA的上清液。
實施例4
利用修改的根據(jù)Chomczynski和Sacchi的規(guī)則(分析生物化學(xué)162,156-159(1987))分離DNA和RNA(以溶劑萃取為基礎(chǔ)的方法的實施例)(圖5)材料和方法從抽血容器轉(zhuǎn)移2ml樣品體積到小試管中。然后加入0.2ml 2M乙酸鈉溶液，pH4,2ml苯酚(水飽和的)和0.4ml氯仿-異戊醇混合物(49∶1)，加入各溶液后充分混合該樣品。將該完全溶液劇烈振蕩10秒鐘并且在冰上溫育15分鐘。該樣品在4℃下以10000g離心20分鐘。離心后RNA在水相中；DNA和蛋白質(zhì)在界面和苯酚相中。將水相轉(zhuǎn)移到新的容器中并且與1ml異丙醇混合。為了沉淀RNA，將該樣品在-20℃貯存1小時。在4℃下以10000g再次離心之后沉積出RNA。將該沉積物再次懸浮于0.3ml緩沖液(4M硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，pH7.0,0.5％十二烷基肌氨酸鈉，0.1M2-巰基異丙醇)，轉(zhuǎn)移到新的1.5ml Eppendorf容器中并且與1體積的異丙醇混合。在-20℃下溫育1小時后，在Eppendorf離心機中在4℃下將溶液離心10分鐘。將RNA沉積物回收到75％乙醇中并且通過離心(Speed vac)濃縮并干燥。對于進一步處理，將樣品溶解于100微升10mM Tris-HCl,pH6.5。
實施例5還原劑(例如DTT)在用于RNA的長期穩(wěn)定性的穩(wěn)定溶液中的重要性材料和方法使用的穩(wěn)定溶液4.0M GTC；13.5％Triton X100；45mM Tris/HCl；有或沒有120mM DTT。700微升的血清與700微升的穩(wěn)定溶液混合。溫育2分鐘后加入20微升MS2-RNA(0.8微克/微升的Roche)。該樣品在40℃溫度下溫育180分鐘，然后以400微升一等份用Roche高純度總RNA試劑盒處理。一步將樣品施加給柱子而不加入試劑盒的結(jié)合劑并且根據(jù)說明進行離心。根據(jù)說明進行下面的洗滌步驟和在50微升洗脫緩沖液中洗脫RNA。
利用瓊脂糖凝膠進行分析(見圖6)。
結(jié)果不向穩(wěn)定溶液中加入還原劑不能實現(xiàn)RNA的長期穩(wěn)定。
實施例6血清中游離的MS2-RNA的穩(wěn)定性。樣品成分對RNA降解的動力學(xué)材料和方法使用10微升MS2-RNA(0.8微克/微升，Roche)添加(spike)250微升血清并且在室溫下溫育。加入RNA后立即，2分鐘至50分鐘之后，通過加入250微升穩(wěn)定溶液終止血清中的自然RNA降解。所有批次的樣品分析兩次。作為標準物，在向血清加入穩(wěn)定溶液后一個樣品只與MS2-RNA混合并且平行處理。
用Roche高純度病毒RNA試劑盒平行處理所有的樣品。一步將樣品加給柱子而不加入試劑盒的結(jié)合劑并且根據(jù)說明書離心。根據(jù)說明書進行下面的洗滌步驟并且在50微升洗脫緩沖液中洗脫RNA。
利用1.2％天然瓊脂糖凝膠分離20微升的洗出液并且分析(見圖7)。
結(jié)果MS2-RNA在血清中不穩(wěn)定。向血清中加入RNA之后2分鐘，RNA完全降解。通過以1∶1的比例向血清中加入穩(wěn)定溶液可以立即終止該過程，并且在加入穩(wěn)定溶液時(=抽血)可以實現(xiàn)RNA的穩(wěn)定作用。
實施例7血清/穩(wěn)定溶液中MS2-RNA的穩(wěn)定性。取決于GTC濃度材料和方法使用的穩(wěn)定溶液3-5M GTC；13.5％Triton X100；50mM DTT；42mMTris/HCl；溶液的pH大約4.0加入血清后溶液的pH大約6.7。
2ml血清與2.5ml的各穩(wěn)定溶液混合。溫育2-5分鐘后加入90微升MS2-RNA(0.8微克/微升，Roche)并且在40℃下溫育。以有規(guī)律的間隔取400微升樣品并且根據(jù)實施例5用Roche高純度總RNA試劑盒平行處理。洗脫出50微升樣品并且在-20℃下冷凍。對于RNA完整性分析，將20微升洗出液施加給1.5％瓊脂糖凝膠(見圖8)。
對于樣品的PCR分析，利用AMV-RT(Roche)逆轉(zhuǎn)錄10微升洗出液并且接著利用Lightcycler上的PCR進行分析RT批 4.0微升AMV-RT緩沖液(42℃,1小時)2.0微升dNTP’s(終濃度10mM)0.5微升RNA酶抑制劑(Roche,20單位)1.0微升引物2827(終濃度1μM)1.9微升DMPC水0.6微升AMV-RT(Roche,15單位)10微升 模板RNA∑20微升使用SYBR-Green作為檢測系統(tǒng)在61℃退火溫度下在Lightcycler上進行PCR。PCR的批1.6微升氯化鎂(分批溶液25mM)5.9微升DMPC水0.25微升 引物2827(分批溶液20mM)0.25微升 引物2335(分批溶液20mM)1.0微升SYBR-Green-Mastermix(Roche)1.0微升RT批次(1∶50稀釋)Σ10微升PCR擴增產(chǎn)物完全施加于2％瓊脂糖凝膠(見圖9)。
結(jié)果40℃3天后的RNA完整性。
圖8中的瓊脂糖凝膠表示40℃溫育3天后20微升洗脫的MS2-RNA。該時期后，根據(jù)GTC含量可以得出RNA完整性的顯著差異。因此，血清/穩(wěn)定溶液中小于2M的鹽含量有利于RNA的完整性。
40℃8天后RNA的擴增性。
盡管已經(jīng)檢測到40℃3天后RNA開始降解，40℃溫育8天后所有的RNA樣品可能擴增并且被清楚地檢測。
PCR的擴增產(chǎn)物完全施加給2％的瓊脂糖凝膠(見圖9)。
實施例8血清/穩(wěn)定溶液中MS2-RNA的穩(wěn)定性。取決于與穩(wěn)定溶液混合的樣品的pH材料和方法使用的溶液4M(5M)GTC14.4％Triton X10050mM DTT45mM Tris/HCl加入血清后的pH在6.7和8.0之間2.5ml穩(wěn)定溶液與2.0ml血清混合。加入90微升MS2-RNA(0.8微克/微升，Roche)之后在室溫下培養(yǎng)樣品。根據(jù)實施例6使用Roche病毒RNA試劑盒以有規(guī)律間隔處理來自500微升樣品中的RNA并且在50微升洗脫緩沖液中分離。利用瓊脂糖凝膠分析20微升洗出液(見圖10)。
結(jié)果血清/穩(wěn)定溶液的pH以及穩(wěn)定溶液的pH和緩沖液范圍對于RNA的長期穩(wěn)定性是決定性的。在pH8.0下2天后已經(jīng)不再能檢測到完整RNA，而室溫下溫育13天后在6.6和7.0之間的pH范圍內(nèi)仍然可檢測到完整的RNA。
然而，除了pH外，優(yōu)化調(diào)節(jié)的GTC濃度對于RNA的長期穩(wěn)定性也是重要的(也見實施例7)。例舉的實施例證明2.2M GTC的穩(wěn)定樣品中的GTC終濃度對于RNA的長期穩(wěn)定性比2.78更好。


圖1含有N-Ss，確定的真空，用隔膜密封的取樣容器。圖2在取樣容器中貯存不同時間的RNA的凝膠分析(1％瓊脂糖)。1柱取樣后直接分離(沒有貯存)，2柱在-20℃下貯存一個月，3柱在4℃下貯存6天。施加的RNA量相當(dāng)于120微升血液體積。圖3在取樣容器中貯存不同時間的DNA的凝膠分析(1％瓊脂糖)。1柱取樣后直接分離(沒有貯存)，2柱在-20℃下貯存一個月，3柱在4℃下貯存6天。施加的RNA量相當(dāng)于10微升血液體積。圖4從10ml血液中分離的mRNA的凝膠分析(1％瓊脂糖)(2柱)。分子量標記(1柱)。除了mRNA外，可見rRNA泳帶。泳帶邊界清晰的形狀證明核酸的完整性。圖5從120微升血液中分離的RNA的凝膠分析(1％瓊脂糖)。圖6有/沒有DTT下在40℃下在血清/穩(wěn)定溶液中溫育180分鐘后分離的MS2-RNA的凝膠分析。1柱正對照MS2-RNA,2柱DNA標記，3,4,5柱與含有DTT的穩(wěn)定溶液溫育之后的MS2-RNA,6,7,8柱與沒有DTT的穩(wěn)定溶液溫育之后的MS2-RNA。圖7在血清中溫育0-50分鐘后分離的MS2-RNA的凝膠分析。10,17柱MS2-RNA標準物，9,16柱DNA標記，7,8柱溫育0分鐘，5,6柱溫育2分鐘，3,4柱溫育5分鐘，1,2柱溫育10分鐘，11,12柱溫育15分鐘，13,14柱溫育30分鐘，15柱溫育50分鐘。圖8在40℃下在血清/穩(wěn)定溶液中溫育3天后分離的MS2-RNA的凝膠分析。相應(yīng)的柱中指示其中溫育相關(guān)的RNA樣品的加入血清后的穩(wěn)定溶液的GTC含量。1柱2.70M GTC,2柱2.5M GTC,3柱2.36M GTC,4柱2.20M GTC,5柱2.08M GTC,6柱1.94M GTC,7柱1.80M GTC,8柱1.66M GTC。圖9在40℃下在血清/穩(wěn)定溶液中分別溫育1天和8天之后分離的MS2-RNA的PCR擴增產(chǎn)物的凝膠分析。1柱1天后分離的RNA的擴增產(chǎn)物，2柱8天后分離的RNA的擴增產(chǎn)物，3柱DNA標記，4柱MS2-RNA正對照10微升RT中0.8微克，1∶50稀釋的1微升的擴增。圖10室溫下在血清/穩(wěn)定溶液中分別溫育6天(2-12柱)和13天(14-19柱)之后分離的MS2-RNA的凝膠分析。相應(yīng)的柱后面寫明了血清和穩(wěn)定溶液混合后獲得的pH。1,13,20柱DNA標記，2柱pH8.0,3柱pH7.7,4柱pH7.5,5柱pH7.35,6柱pH7.18,7,14柱pH7.07,8,15柱pH6.94,9,16柱pH6.8,10,17柱pH6.72,11,18柱pH6.68和12,19柱pH6.7。12,19柱中RNA的穩(wěn)定溶液具有和11柱中RNA的相同的pH，但是含有5m GTC而不是4M。
權(quán)利要求
1．一種用于抽血的容器，含有具有下面成分的水溶液-胍鎓鹽；-緩沖物質(zhì)；-還原劑；和/或-去污劑。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的容器，特征在于胍鎓鹽選自硫氰酸胍鎓和氯化胍鎓。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2任一項的容器，特征在于胍鎓鹽以1-8.0M的濃度存在，優(yōu)選2.5-8.0M。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的容器，特征在于緩沖物質(zhì)選自Tris,HEPES,MOPS，檸檬酸鹽和磷酸鹽緩沖液。
5．根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的容器，特征在于緩沖物質(zhì)以10-300mM的濃度存在。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的容器，特征在于去污劑選自Triton-X-100,NP-40,polydocanol和Tween20。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項的容器，特征在于去污劑以5-30％重量的濃度存在。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的容器，特征在于還原劑選自二硫蘇糖醇，β-巰基乙醇和TCEP。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的容器，特征在于還原劑以0.1-10％重量的濃度存在。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項的容器，特征在于所述溶液的pH在4.0和7.5之間，優(yōu)選在4.0和6.5之間。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項的容器，特征在于所述溶液含有下面的成分-4m硫氰酸胍鎓；-45mM Tris/HCl；-15％(w/v)Triton-X-100；-0.8％(w/v)DTT，其中pH是6.0。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項的容器，特征在于其用來接收血液的腔中具有真空度。
13．根據(jù)權(quán)利要求1-12任一項的容器，特征在于其含有抽出的血液。
14．一種抽血方法，包括直接將血液導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項的容器的步驟。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，特征在于抽取的血液量是容器中溶液體積的0.1至4倍。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的方法，特征在于供血后胍鎓鹽的終濃度在1.0M和5M之間，優(yōu)選1.5和5M之間。
17．一種穩(wěn)定和/或從血液中分離核酸的方法，包括將血液導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項的容器中的步驟，并且任選地，使用常規(guī)方法分離核酸。
18．根據(jù)權(quán)利要求14的方法，特征在于調(diào)節(jié)溶液的pH使得加入樣品材料之后獲得4.0和7.5之間的pH。
19．根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項的容器用于抽血，優(yōu)選從人抽血的用途。
20．容器中含有胍鎓鹽，緩沖物質(zhì)，去污劑和/或還原劑的溶液用于抽血的用途。
21．通過將全血引入根據(jù)權(quán)利要求1-13任一項的容器中獲得的穩(wěn)定化的血液樣品。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的血液樣品，特征在于其具有4.0-7.5，優(yōu)選6.6-7.0的pH。
23．根據(jù)權(quán)利要求21或22的血液樣品，特征在于其從人血液產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種含有包括胍鎓鹽,緩沖物質(zhì),還原劑和/或去污劑的溶液的用于血液采樣的容器。該容器特別在用于檢測核酸的血液取樣。
文檔編號G01N33/48GK1321200SQ99811245
公開日2001年11月7日 申請日期1999年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月12日
發(fā)明者E·赫爾芬貝恩 申請人:格萊恩比奧-奧內(nèi)有限公司, 安蒂根有限公司