專利名稱：過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法及測(cè)定用試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法，另外本發(fā)明還涉及在上述測(cè)定方法中使用的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑。
使用魯米諾(氨基苯二酰肼)等的化學(xué)發(fā)光法作為遷氧化物酶(以下說明書中稱為POD)的測(cè)定方法是公知的。為了提高該化學(xué)發(fā)光法測(cè)定的靈敏度，曾提出使用對(duì)位取代的苯酚衍生物。例如，曾報(bào)道在魯米諾-H2O2-POD化學(xué)發(fā)光中使用對(duì)碘代苯酚可使發(fā)光增強(qiáng)(Kricka，etal，Anal.BioChem.，145，96，1985)。
在魯米諾水溶液中魯米諾陰離子存在下，由于對(duì)位取代酚的氧化作用被轉(zhuǎn)化成二氣半酮(ジァザセミキノン)自由基，再經(jīng)過幾個(gè)中間體，生成最終產(chǎn)物3-氯基苯二酸并發(fā)光。碘代苯酚(碘代苯酚自由基)作用于魯米諾，對(duì)二氮半酮自由基的生成有促進(jìn)作用。使用上述原理的免疫測(cè)定試劑商品名是amerlite，由日本ュダック·ダィァグノステックス株式會(huì)社銷售。
另外，在抗壞血酸-H2O2-POD中添加對(duì)甲甲氧苯酚，使抗壞血酸自由基敏感性提高是公知的(Chance B.)Arch.Biochem.Biophys.，41，389，1952)。對(duì)甲苯酚(Ohnishi，T.et.，BioChem，Biophys.Acta，1972，357，1969)，和甲狀腺素及類似物(Klebanoff，S.J.，J.Biol.Chem.，234，pp2437-2442，1972)也有可能用于同樣的反應(yīng)。
對(duì)位取代酚衍生物使魯米諾發(fā)光增強(qiáng)及抗壞血酸自由基敏感，并由此可用作測(cè)定過氧化物酶時(shí)的增感劑的原因被認(rèn)為是由過氧化物酶生成的苯氧自由基作用于魯米諾和抗壞血酸所進(jìn)行的電子轉(zhuǎn)移(氧化)反應(yīng)。但是，即使采用上述使發(fā)光增強(qiáng)及自由基敏感的檢測(cè)方法，過氧化物酶的檢測(cè)敏感度仍不夠充分，特別是，即使基于自由基敏感增加的過氧化物酶的檢測(cè)敏感度大到10-3單位/ml，作為酶免疫測(cè)定試劑的敏感度還是明顯不夠的。
本發(fā)明的目的是提供一種敏感度高的過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法，本發(fā)明的另一目的是提供一種用于提高過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定敏感度的試劑。
在用對(duì)位取代酚衍生物作為增感劑的場(chǎng)合，所能達(dá)到的增感效率，可能依賴于在過氧化物酶的作用下生成的苯氧自由基的壽命。因此，本發(fā)明人從作為反應(yīng)中間體的魯米諾-自由基和作為反應(yīng)中間產(chǎn)物抗壞血酸自由基的穩(wěn)定性和增感作用的關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中考慮到，利用不穩(wěn)定的自由基的上述方法不可能大幅度地提高測(cè)定的敏感度，于是深入研究出了產(chǎn)生穩(wěn)定的苯氧自由基的增感劑，以及將苯氧自由基轉(zhuǎn)變成信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng)的穩(wěn)定的其它類自由基的試劑。
其結(jié)果，由于作為增感劑的對(duì)位取代酚衍生物生成的苯氧自由基和羥胺衍生物的結(jié)合，得到了穩(wěn)定的信號(hào)強(qiáng)度更強(qiáng)的一類自由基，并且當(dāng)使用了上述羥胺衍生物，將對(duì)位乙酰氨基苯酚衍生物作為增感劑使用時(shí)，可以使過氧化物酶測(cè)定的敏感度大大提高，而且，在同類反應(yīng)中，使用過量的過氧化物酶，也可以進(jìn)行過氧化氫的測(cè)定。
在上述見解的基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
也就是說，本發(fā)明的過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法包括以下步驟(a)在過氧化物酶或過氧化氫任何一方過量情況下，于過氧化氫存在下，通過過氧化物酶的作用用羥胺化合物捕捉從對(duì)位取代的酚類化合物生成的苯氧自由基，從而于生成一類穩(wěn)定的自由基工序，以及(b)提供一種包括測(cè)定上述穩(wěn)定自由基的電于自旋共振工序。
作為本發(fā)明的較好方案，提供了對(duì)位取代酚類化合物是如下式1所示的4-乙酰氨莖苯酚衍生物的上述方法。式1 (式中R1，是氫原子或1-6碳原子的烷基，R2是1-6個(gè)碳原子的烷基，羥基，1-6個(gè)碳原子的烷氧羰基)，以及對(duì)位取代的酚化合物是4-乙酰氨基苯酚衍生物的方法；以及對(duì)位取代的酚化合物是從4-甲氧基苯酚，4-乙氧基苯酚，4-碘代苯酚，3-(4-羥基苯酚)丙酸(HPPA)，4-羥基苯乙酸，4-羥基馬尿酸，對(duì)甲苯酚以及鉻胺(3-對(duì)羥苯基乙胺)其中選擇出的一種的上述的方法。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，提供了在過氧化氫和對(duì)位取代酚，最好是上述4-乙酰氨基苯酚衍生物存在下，將由于過氧化物酶的作用生成的苯氧自由基捕捉，從而能生成一類穩(wěn)定的自由基的羥胺化合物構(gòu)成的過氧化物酶或測(cè)定過氧化氫用的試劑。并且提供了在過氧化氫和對(duì)位取代酚，最好是上述4-乙酰氨基苯酚衍生物存在下，將由于過氧化物酶的作用生成的苯氧自由基捕捉，能夠生成穩(wěn)定的自由基的苯氧自由基捕捉劑的羥胺化合物。
本發(fā)明的羥胺化合物是一種作為測(cè)定過氧化物酶或過氧化氫試劑的化合物，它具有在過氧化氫和對(duì)位取代酚化合物存在下，將由于過氧化物酶的作用形成的苯氧自由基捕捉，從而生成穩(wěn)定的自由基的性質(zhì)。雖然無需拘泥于任何特定的理論，因?yàn)檫@種羥胺化合物能捕獲苯氧自由基，生成穩(wěn)定的NO自由基，由于在電子自旋共振(ESR)裝置中這類穩(wěn)定的自由基能被選擇性地檢知，因而使有可能以極高靈敏度測(cè)定過氧化物酶或過氧化氫，而且，在本發(fā)明的說明書中，包括以定性和/或定量分析為目的的所有測(cè)定方法。
作為過氧化酶或過氧化氫測(cè)定用試劑，所使用的羥胺化合物，只要是能夠捕捉苯氧自由基層，生成穩(wěn)定的自由基種，任何種類的都可以。羥基胺化合物是否具有本發(fā)明方法中所具有的特性，按照本發(fā)明實(shí)施例中所記載的方法，本專業(yè)人員可容易地判定。此外，自由基種的穩(wěn)定性可用自由基壽命和信號(hào)強(qiáng)度的經(jīng)時(shí)變化判定。
作為好的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑，可以使用將作為自由基自旋標(biāo)記劑使用的氮氧化物(硝酸試劑)還原得到的具有上述特性的羥胺化合物。作為原料使用的氮氧化物，可以使用，例如有TEMPO(2，2，6，6-四甲基-1-哌啶基氧化物)及衍生物；PRIOXYL及衍生物；PROXYL(2，2，5，5-四甲基吡咯烷氧化物)及衍生物；羥基-PTIO[2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-氧基-3-氧化物)及衍生物；DOXYL(4，4-二甲基-3-噁，唑啉氧化物)及衍生物等。上述化合物均可買到。
(例如參照西格瑪″自旋標(biāo)記和自旋捕獲″1943，95年版)容易地制備?；蚴褂美缱鳛榫C述的由株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所發(fā)表的″原卟啉鈉新聞No。1″(渡部德子著)″生物高分子自旋標(biāo)記法的應(yīng)用″(1976年)中記載了氮氧化物系列的自旋標(biāo)記劑及作為原料的氮氧化合物。
適用于本發(fā)明的羥胺化合物可以舉出從下述化合物 (式中R3是羥基，取代或未取代的氨基(最好是未取代的氨基)，羧基，或1-6個(gè)碳原子的烷氧羰基；R4是氫原子，1-6個(gè)羰原子的烷基(最好是甲基)或肼基；R5是羥基，取代或未取代的氨基(最好是1-6個(gè)碳原子的烷基羰基取代的氨基或未取代的氨基)，羥基，取代或未取代的氨基甲?；?最好是未取代的氨基甲?；?；R6是氫原子或1-6個(gè)碳原子的烷基(最好是甲基)；R7是氫原子或1-6個(gè)碳原子的烷基(最好是甲基))中選出的羥胺化合物。
上述好的羥胺化合物，可以將作為自由基自旋標(biāo)記劑使用的氮氧化合物作為原料通過還原反應(yīng)來制備，能夠具有捕捉苯氧自由基生成穩(wěn)定的自由基的特性。這類化合物可以按照文獻(xiàn)記載的方法，或者根據(jù)文獻(xiàn)記載的方法適當(dāng)改變?cè)匣蛟噭┮约敖?jīng)修飾能夠很容易地制備出來。而且，例如4-亞肼基甲基-1-羥基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO)可以從市場(chǎng)上買到(ァルドリッチ社No 33，114-7)，必要時(shí)可進(jìn)行精制，稀釋等。
作為原料化合物的氣氧化物的還原，例如可以使用抗壞血酸等的穩(wěn)定的還原劑。另外，雖然有按照還原的方法羥胺基可進(jìn)一步被還原，生成氨基化合物(RR′NH)的情況，但因?yàn)檫@種氨基化合物用電子自旋共振是檢測(cè)不出來的，所以即使在本發(fā)明的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑中混雜有少量這種氨基化合物，實(shí)際上并不會(huì)成為問題。一般而言，可以用′H-NMR測(cè)定羥胺化合物的純度。
在本發(fā)明方法中，也可以將兩種以上的上述羥胺化合物聯(lián)合使用。作為苯氧自由基捕捉劑及過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定試劑特別適宜的羥胺化合物的實(shí)例如下，但測(cè)定用試劑并不被限定于這些化合物。 在本發(fā)明方法中使用的對(duì)位取代的酚類化合物，至少是對(duì)位有任意取代基的酚類化合物，而且，與過氧化物酶催化的過氧化氫的分解反應(yīng)一起，很容易被轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的苯氧自由基時(shí)，對(duì)于對(duì)位取代酚類的種類無需有特別的限定。這種對(duì)位取代的酚類化合物在本發(fā)明中是作為過氧化物酶催化的過氧化氫分解反應(yīng)的增感劑起作用的。對(duì)位取代的酚類化合物是否有上述特性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實(shí)施例中說明的方法予以判定。
上述對(duì)位取代的酚類化合物，在間位和或鄰位有取代基也是可以的。對(duì)于對(duì)位取代酚類化合物苯環(huán)上存在的對(duì)位取代基，以及對(duì)位以外的1或2個(gè)取代基的種類無特殊限制。有兩個(gè)以上取代基的情況，各取代基相同或不同都是可以的。作為這種取代基的實(shí)例有1-6個(gè)碳的烷基。1-6個(gè)碳的鏈烯基，1-6個(gè)碳的炔基，1-6個(gè)碳的烷氧基，鹵素，1-6個(gè)碳的鹵代烷基，羧基，1-6個(gè)碳的羧基烷基，1-6個(gè)碳的烷氧羰基，羥基，1-6個(gè)碳的羥烷基，取代或未取代的氨基甲?；榛〈蛭慈〈陌被?，酰氨基，烷氧羰基氨基等。
作為烷基，鏈烯基，炔基或烷氧基，直鏈或支鏈都是可以的。含不飽和鍵時(shí)，不飽和鍵在任何位置均可。作為鹵素原子，可以是氟，氯，溴，碘中的任何鹵原子。具體的對(duì)位取代酚類化合物，例如可以舉出4-甲氧基苯酚，4-乙氧基苯酚，4-碘苯酚，3-(4-羥基苯基)丙酸(HPPA)，4-羥基苯乙酸，4-羥基馬尿酸，對(duì)甲苯酚及3-對(duì)羥苯基乙胺等。
另外，作為本發(fā)明方法中較好的對(duì)位取代的酚類化合物，可以舉出上述用式1表示的4-乙酰氨基苯酚衍生物(式中R1是氫原子，或1-6個(gè)碳原子的烷基，R2是1-6個(gè)碳原子的烷基，羧基，1-6個(gè)碳原子的烷氧羰基)?；?，特別好的化合物是R1是氫原子的上述化合物。并且可以舉出R1是氫原子并且R2是CH3，C2H5，C3H7，COOH，OCH3，OC2H5的化合物。
本發(fā)明方法測(cè)定的對(duì)象可以舉出過氧化物酶及和它有同樣催化作用的物質(zhì)例如血紅朊等。詳細(xì)的測(cè)定方法在下述實(shí)施例中詳細(xì)說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例說明的限制，本領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)于實(shí)施例方法和裝置作適當(dāng)?shù)男薷暮妥兓?，?dāng)然可以作出適宜的選擇。
實(shí)施例下面用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的具體說明，本發(fā)明的范圍不受下述實(shí)施例的限制。實(shí)施例1過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑的制備(1)將1g(4.99mmol)羧基-PTIO(2-(4-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-烴氧基-3-氧化物，株式會(huì)社同仁化學(xué)研究所制造)溶于5ml甲醇中，室溫下加入2倍摩爾量的抗壞血酸，攪拌，生成白色沉淀，過濾生成的白色沉淀，用少量甲醇及水洗滌并干燥，得到本發(fā)明的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑羧基-PTIOH[2-(2-羧基苯基)-4，4，5，5-四甲基咪唑啉-1-N-羥基-3-氧化物。
(2)將200mg(7.21mmol)羧基-TEMPO(4-羧基-2，2，6，6-四甲基哌啶氧化物)(ァル ドリッチ制造)溶于2ml甲醇中，加入2倍摩爾量的抗壞血酸，攪拌，生成白色沉淀，過濾出白色沉淀，用少量甲醇和水洗滌并干燥，得到本發(fā)明的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑(4-羧基-2，2，6，6-四甲基-1-N-羥基哌啶。實(shí)施例2過氧化物酶的測(cè)定作為測(cè)定用緩沖液，使用含有0.015％H2O2的0.1MOPS(PH6.5)的緩沖液，用對(duì)乙酰氨基苯酚(25mM水溶液)作為基液，作為過氧化物酶測(cè)定試劑的羥胺化合物，使用4-亞肼基甲基-1-羥基-2，2，5，5-四甲基-3-咪唑啉-3-氧化物(HHTIO，ァルドリッチ社的50μg/ml的DMSO溶液或者實(shí)施例1中(2)的羥胺化合物(羧基-PTIOH)的50μg/ml的DMSO溶液。作為酶液，使用通過0.01MDIPSO緩沖液(PH6.5)調(diào)節(jié)的10-4單位/ml的過氧化物酶溶液。
將測(cè)定用緩沖液100μl)，超純水(110μl)，基質(zhì)液(30μl)，羥胺化合物(10μl)及酶液50μl)混合，室溫下反應(yīng)15分鐘后，生成的NO自由基用日本電子社制造的JES-FR80電子自旋共振儀測(cè)定。


圖1表示測(cè)定結(jié)果。圖中(a)表示羧基-PTIOH的結(jié)果，(b)表示HHTIO的結(jié)果，上部分是空白的測(cè)定結(jié)果。從上述結(jié)果可以明顯看出，在添加對(duì)位取代苯酚時(shí)，ESP信號(hào)強(qiáng)度明顯強(qiáng)于空白(不添加過氧化物酶)。ESR的測(cè)定條件如下中心磁場(chǎng)3346±50高斯；調(diào)制磁場(chǎng)100KHz，1.0高斯，微波輸出20mw，放大率100倍，50倍，應(yīng)答時(shí)間0.1秒。實(shí)施例3用對(duì)羥基乙酰苯胺衍生物測(cè)定過氧化物酶。
作為對(duì)位取代酚類衍生物，使用對(duì)羥基乙酰苯胺衍生物，對(duì)甲氧莖苯酚，對(duì)甲苯酚，甲狀腺素，及3-(4-羥苯莖)丙酸(HPPA)，并使用HHTIO作為羥胺化合物，對(duì)過氧化物酶進(jìn)行測(cè)定。用含0.015％H2O20.1M的MOPS緩沖液(PH6.5)的作測(cè)定緩沖液，用25mM水溶液作測(cè)定基質(zhì)液。作為酶液，使用以0.01MMOPS(PH7.0)緩沖液調(diào)整10-4單位/ml的POD溶液，HHTIO液是用DMSO調(diào)整為50μg/ml的溶液。
將POD溶液50μl加到測(cè)定緩沖液100μl，基質(zhì)液30μl，H2O120μl，HHTIO液10μl中，室溫反應(yīng)30分鐘后，用日本電子社制造的JES-FR80電子自旋共振義測(cè)定生成的自由基量。ESR的測(cè)定條件如下中心磁場(chǎng)3346±50高斯，調(diào)制磁場(chǎng)100KHz，1.0高斯，微波輸出20mW，放大率100倍，50倍，應(yīng)答時(shí)間0.3秒。結(jié)果示于表1(表中增感效率＝峰高/空白)。對(duì)羥基乙酰苯胺衍生物顯示比其它酚類化合物高的增感效率。
表1
實(shí)施例4；用發(fā)色試劑ABTS，OPD和本發(fā)明的測(cè)定方法的敏感度進(jìn)行比較。
用廣泛用于過氧化物酶測(cè)定的代表性發(fā)色劑ABTS[2，2′-連氮基-雙(3-乙莖-苯并噻唑啉-6-磺酸]及OPD(鄰亞苯基二胺)和本發(fā)明的測(cè)定方法進(jìn)行比較。在用ABTS測(cè)定時(shí)，使用添加了日本化藥社制造的テナュンザム439kit的基質(zhì)緩沖液和發(fā)色劑，使用將ABTS濃度調(diào)整到2.5mg/ml的基質(zhì)液300μl；在用OPD測(cè)定時(shí)，使用添加了ァボッド社制造的HBS抗原測(cè)定試劑才-スザィムII的OPD片劑一片的OPD溶液加入5ml溶解液使用將OPD濃度調(diào)節(jié)為3mg/ml的基質(zhì)液300μl。在每種基質(zhì)液中加入過氧化物酶溶液(10-5μ/ml)50μl，室溫反應(yīng)30分鐘，在用ABTS測(cè)定時(shí)，加1000μl水，在用OPD測(cè)定時(shí)加1N1000μl硫酸，以使反應(yīng)液淬熄停止反應(yīng)，分離出1000μl最終反應(yīng)液，用日立制作所制造的分光光度計(jì)U-2000測(cè)定OD值，ABTS測(cè)定波長(zhǎng)為415nm，OPD測(cè)定波長(zhǎng)為490nm。
用羥胺化合物的本發(fā)明方法的測(cè)定條件是，除超純水為160μl，放大率為200倍以外，其它按實(shí)施例3方法進(jìn)行，結(jié)果列于表2。另外依本發(fā)明方法測(cè)定的結(jié)果如圖2所示。圖2中，(a)是羧基-PTIOH的測(cè)定結(jié)果，(b)是HHTIO的測(cè)定結(jié)果。在使用ABTS及OPO時(shí)，S/N的比值分別是3.0及3.3，在本發(fā)明方法中用HHTIO時(shí)，S/N是47.6，用PTIO時(shí)S/N是15.3，可見本發(fā)明測(cè)定方法和已往的方法比較有顯著高的靈敏度。
表2
實(shí)施例5在H2O2稀釋液(濃度％)100μl中加入DIPSO緩沖液100μl(0.1M，PH7.0)，對(duì)乙酰氨基苯酚30μl(20mmol/l)，HHTIO 10μl(1mmol/l)和過氧化物酶溶液50μl(10-1單位/ml)，室溫反應(yīng)10分鐘，用ESR測(cè)定生成的自由基量。過氧化物酶比H2O2是大大過量的。測(cè)定時(shí)使H2O2稀釋液的濃度變化5次(0.625*10-6％，1.25*10-6％，2.5*10-6％，5.0*10-6％，10*10-6％)，測(cè)定結(jié)果如圖3和圖4所示，圖3是各種濃度下ESR信號(hào)的波形，圖4是濃度與ESR信號(hào)之間關(guān)系的圖示。從圖4可明顯看出ESR信號(hào)強(qiáng)度和過氧化氫濃度顯示出正比關(guān)系，可以檢出濃度為1.25*10-6％的過氧化氫。ESR的測(cè)定條件如下，中心磁場(chǎng)337.500mT，調(diào)制磁場(chǎng)0.100KHz，0.1mT，微波輸出10mW，放大率200倍，應(yīng)答時(shí)間0.1秒實(shí)施例6；對(duì)于生物化學(xué)檢查的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例5，在過氧化物酶比H2O2過量存在時(shí)，可以進(jìn)行H2O2的定時(shí)測(cè)定。在生物檢查項(xiàng)目中，由于可以對(duì)酶反應(yīng)生成的H2O2進(jìn)行定量測(cè)定，存在將其作為目的成份的定量測(cè)定項(xiàng)目。作為這種檢查項(xiàng)目可以舉出葡萄糖，乳糖，丙酮酸，唾液酸，尿酸，肌酸酐，多胺，總膽甾醇，游離膽甾醇，中性肪脂，磷脂，游離脂肪酸，無機(jī)磷等。所以當(dāng)遇到測(cè)定這些檢查項(xiàng)目時(shí)，可以用本發(fā)明的測(cè)定方法定量地測(cè)定酶反應(yīng)生成的H2O2。
作為本發(fā)明應(yīng)用于生物化學(xué)檢查的一個(gè)例子，以下是將本發(fā)明的測(cè)定方法用于葡萄糖定量測(cè)定的示例。
將MOPS緩沖液(0.1M，PH6.5)100μl，對(duì)乙酰氨莖苯酚(20mmol/l)50μl，含已知量葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100，200，400mg/dl)或控制血清(Moni-Trol I&II，Baxter Diagnostic Inc)1μl，HHTIO(3mmol/l)10μl，過氧化物酶溶液(10-1單位/ml)50μl，葡萄糖氧化酶(5單位/ml)50μl混合，于37℃攪拌10分鐘，加反應(yīng)終止劑NaN3(500mmol/l)50μl之后進(jìn)行ESR測(cè)定。
圖5(a)是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到的ESR信號(hào)的波形，圖5(b)是用控制血清Moni-TrolI&II得到的ESR信號(hào)波形?；跇?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)求出的Moni-TrolI&II的值分別是80mg/dl和235mg/dl，和各控制血清中表示的葡萄糖值十分一致。
以高的靈敏度測(cè)定過氧化物酶或過氧化氫，使過去不可能進(jìn)行的稀薄的(濃度低的)過氧化物酶或過氧化氫的分析成為可能。
附圖的說明圖1是；被苯氧自由基氧化的羥胺化合物的ESR譜圖。圖中(a)是羧基-PTIOH作羥胺化合物的示例；(b)是用HTIO作羥胺化合物的示例，上部分是空白的測(cè)定結(jié)果。圖2是關(guān)于過氧化物酶溶液(10-5單位/ml)的本發(fā)明測(cè)定方法的S/N值的圖示。圖中(a)是用羧基-PTIOH作羥胺化合物的示例，(b)是用HHTIO作羥胺化合物的示例，上部分是空白的測(cè)定結(jié)果。圖3是是實(shí)施例5中，過氧化氫濃度的測(cè)定得到的ESR波形圖。圖4是是實(shí)施例5中過氧化氫濃度和ESR信號(hào)強(qiáng)度之間的關(guān)系的圖示。圖5是是實(shí)施例6中得到的ESR波形圖。(a)是用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得到的圖形，(b)是用控制血清得到的圖形。
權(quán)利要求
1.過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法，包括以下步驟(a)在過氧化物酶或過氧化氫任何一方對(duì)另一方過量的情況下，在過氧化氫存在下，用羥胺化合物捕捉由于過氧化物酶的作用從對(duì)位取代的酚類化合物生成的苯氧自由莖基，從而生成穩(wěn)定的自由基種；以及(b)用電子自旋共振測(cè)定上述穩(wěn)定的自由基種。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)位取代的酚類化合物是用下式表示的4-乙酰氨基苯酚衍生物 式中，R1是氫原子或1-6個(gè)碳原子的烷基，R2是1-6個(gè)碳原子的烷基，羧基，1-6個(gè)碳原子的烷氧羰莖。
3.按照權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)位取代的酚類化合物選自4-甲氧基苯酚，4-乙氧基苯酚，4-碘代苯酚，3-(4-羥基苯基)丙酸，4-羥基苯乙酸，4-羥基馬尿酸，對(duì)甲苯酚，以及3-對(duì)羥苯基乙胺。
4.一種過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑，它是在過氧化物酶和對(duì)位取代酚類化合物存在下，能夠捕捉由于過氧化物的作用生成的苯氧自由基并生成一類穩(wěn)定自由基種的羥胺化合物。
5.按照權(quán)利要求4的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定試劑，其中對(duì)位取代酚類化合物是權(quán)利要求2中記載的4-乙酰氨基苯酚衍生物。
6.按照權(quán)利要求4或權(quán)利要求5的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定試劑，其中的羥胺化合物是由用作自由基自旋標(biāo)記劑的氮氧化合物還原制備的。
7.權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)記載的方法中使用的權(quán)利要求4-6中任何一項(xiàng)的過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定用試劑。
8.在過氧化氫和對(duì)位取代酚類衍生物存在下，能夠捕捉由于過氧化物酶作用生成的苯氧自由基并生成穩(wěn)定的自由基種的羥胺化合物。
全文摘要
提供了高靈敏度的過氧化物酶或過氧化氫的測(cè)定方法。該過氧化物酶或過氧化氫測(cè)定方法是，在過氧化物酶或過氧化氫任何一方對(duì)另一方過量的情況下，在過氧化氫存在下，用羥胺化合物捕捉由于過氧化物酶的作用從對(duì)位取代的酚類化合物生成的苯氧自由莖，生成穩(wěn)定的自由基，用電子自旋共振測(cè)定所生成的穩(wěn)定的自由基。
文檔編號(hào)G01R33/60GK1150178SQ96112298
公開日1997年5月21日 申請(qǐng)日期1996年7月20日 優(yōu)先權(quán)日1995年7月20日
發(fā)明者青山正明, 志賀匡宣 申請(qǐng)人:日本電子株式會(huì)社, 財(cái)團(tuán)法人山形縣高度技術(shù)城市財(cái)團(tuán)