專(zhuān)利名稱(chēng)：直接讀取結(jié)果的試紙的制作方法
本申請(qǐng)是下列美國(guó)申請(qǐng)的部分接續(xù)申請(qǐng)1995年3月27日申請(qǐng)的第411238號(hào)；1995年5月15日申請(qǐng)的第442035號(hào)。
本申請(qǐng)涉及一種測(cè)量生物體液中的被分析物濃度的干試紙；更確切地說(shuō)，是一種不借助儀表直接測(cè)量濃度的試紙。
目前對(duì)生物體液中某些被分析物濃度的測(cè)量，已開(kāi)發(fā)出了多種目測(cè)試驗(yàn)裝置。例如，這些裝置可以測(cè)量血液、尿液或唾液中的葡萄糖、膽固醇、蛋白質(zhì)、酮、苯丙氨酸或酶的濃度。
結(jié)合了以酶為主的組合物的干相試紙?jiān)谂R床實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)生的診所、醫(yī)院和家庭中已被廣泛用于測(cè)量生物體液樣品的葡萄糖濃度。實(shí)際上，這種試紙已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)幾百萬(wàn)糖尿病患者的每日必需品。由于糖尿病可能引起血液化學(xué)異常改變的危險(xiǎn)，從而會(huì)導(dǎo)致視覺(jué)喪失、腎衰竭及其它嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)后果。為把這些后果的危險(xiǎn)減少到最小程度，大多數(shù)糖尿病人必須定期進(jìn)行自身的測(cè)量，然后據(jù)此通過(guò)控制飲食和/或注射胰島素來(lái)調(diào)整葡萄糖濃度。一些病人每天必須四次或更多次地測(cè)量血溏濃度。
糖尿病人必須控制飲食以調(diào)節(jié)糖的攝入和/或胰島素的注射，而且在經(jīng)常性地測(cè)量血濃度方面必須接受指導(dǎo)，因此，對(duì)于他們來(lái)說(shuō)，用于快速、價(jià)廉和準(zhǔn)確的葡萄糖測(cè)定的試紙尤為重要。
公知的試紙包含一種指示劑，當(dāng)某種生物體液點(diǎn)到試紙上后，指示劑依賴(lài)于其中的葡萄糖濃度產(chǎn)生顏色深淺的變化。盡管一些試紙應(yīng)用了還原過(guò)程，但更普遍的是試紙含有一種可氧化的染料或染料對(duì)。這樣的試紙包括一種酶，例如葡萄糖氧化酶，它能將葡萄糖氧化為葡萄糖酸或過(guò)氧化氫。它們也含有一種可氧化的染料和一種具有過(guò)氧化活性的物質(zhì)，后者在過(guò)氧化氫存在的條件下，能選擇性地催化氧化可氧化的染料。(參見(jiàn)1994年4月26日公布的Kiser等的美國(guó)專(zhuān)利5,306,623)。
1976年6月22日公布的Hochstrasser的美國(guó)專(zhuān)利3964871公開(kāi)了一種一次性的指示劑試紙，它可直接測(cè)量生物體液中的物質(zhì)，例如葡萄糖的濃度。該指示劑能夠記錄下物質(zhì)的濃度；它包括一種與物質(zhì)反應(yīng)后氧化變色的指示試劑，還包括一種＂拮抗試劑＂，這種＂拮抗試劑＂以某種方式防止氧化過(guò)的指示試劑的累積；直到它被完全消耗掉為止。
Palmer等在1989年5月24日公布的歐洲專(zhuān)利申請(qǐng)0317070中公開(kāi)了一種葡萄糖和其它被分析物的＂數(shù)字＂定量測(cè)定系統(tǒng)。系統(tǒng)測(cè)量某種生物體液中的一種有機(jī)化合物的濃度，首先要將這種化合物用一種專(zhuān)屬氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化氫。該系統(tǒng)包括一個(gè)作為過(guò)氧化氫還原劑發(fā)色團(tuán)和一個(gè)具有更大還原電勢(shì)的空氣中穩(wěn)定的過(guò)氧化氫還原劑。更大的還原電勢(shì)延遲了任何由發(fā)色團(tuán)帶來(lái)的顏色變化，直到首先消耗掉空氣中穩(wěn)定的過(guò)氧化氫還原劑。因此，如果要測(cè)的過(guò)氧化氫低于預(yù)定的水平，即小于空氣中穩(wěn)定的過(guò)氧化物還原劑的濃度，將不會(huì)發(fā)生變色。結(jié)果是，系統(tǒng)定量測(cè)量了濃度，而不依賴(lài)于顏色改變的強(qiáng)度。
Englemann在1988年4月19日公布的美國(guó)專(zhuān)利4738823中公開(kāi)了一種測(cè)定被分析物的試紙，它有一個(gè)載體，含有一種有吸收性的材料，可除去點(diǎn)到試紙上過(guò)剩的樣品。試紙還可以包括一個(gè)用來(lái)引入樣品的開(kāi)口的覆蓋層。
Burkhardt等人在1989年3月7日公布的美國(guó)專(zhuān)利4810470中公開(kāi)了一種測(cè)量液體樣品中被分析物濃度的裝置。該裝置包括一種或多種吸水基質(zhì)，其上涂覆一層液體不能滲透的包衣或薄膜。把樣品沉積在吸水基的部分上，用色譜法測(cè)量。通過(guò)毛細(xì)作用，把樣品移至含有被分析物檢測(cè)試劑的測(cè)定區(qū)。
Daffern等人在1991年2月19日公布的美國(guó)專(zhuān)利4994238中公開(kāi)了一種化學(xué)分析裝置，該裝置由一個(gè)吸收層、一個(gè)防水層和一個(gè)試劑層組成，試劑層有確定值。試劑層上面蓋壓著吸收層和防水層，吸收層和防水層上有呈線性排列的小孔，樣品即通過(guò)小孔點(diǎn)到試劑層上。
濃度測(cè)量無(wú)論在家庭、醫(yī)務(wù)室、診所還是在醫(yī)院中進(jìn)行，葡萄糖測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性都是絕對(duì)重要的。指示顏色的試紙要求變色必須明顯、突出，而且對(duì)生物體液中除葡萄糖以外的各種成分都不敏感。對(duì)可讀取結(jié)果的試紙，依賴(lài)于葡萄糖濃度的改變而產(chǎn)生明顯的顏色變化，對(duì)于有可能視力減弱的糖尿病人來(lái)說(shuō)，尤為重要；顯示在指定波長(zhǎng)因吸收值的改變而引起的顏色變化，對(duì)用儀表測(cè)量的試紙的準(zhǔn)確性也是很重要的。
由于變色涉及一系列化學(xué)反應(yīng)過(guò)程，變色不是瞬時(shí)發(fā)生的。因此，用戶必須等上一段時(shí)間—一般為一分鐘以內(nèi)—反應(yīng)才會(huì)發(fā)生。當(dāng)代表從試紙上讀取結(jié)果時(shí)，計(jì)時(shí)器線路會(huì)產(chǎn)生一個(gè)信號(hào)，表明反應(yīng)完畢。不過(guò)，當(dāng)試紙可直接讀取結(jié)果，而無(wú)需儀表時(shí)，用戶也許會(huì)低估了反應(yīng)所用的時(shí)間，過(guò)早讀取試紙的結(jié)果，而得到不正確的結(jié)果。或者，用戶也許會(huì)在讀取試紙結(jié)果之前，為反應(yīng)進(jìn)行需要等上足夠的時(shí)間，以確定反應(yīng)完畢，這種不必要的耽擱是令人不快的。這就需要一種＂化學(xué)＂計(jì)時(shí)劑，也就是說(shuō)，試紙中含有一種成份，發(fā)生變色且與樣品葡萄糖(或其它有關(guān)被分析物)濃度無(wú)關(guān)；但是變色僅僅發(fā)生在足夠長(zhǎng)的時(shí)間之后，以使和樣品進(jìn)行的顏色形成反應(yīng)完成。
按照本發(fā)明，用于測(cè)量點(diǎn)在試紙上的生物體液樣品中被分析物的濃度的一種延長(zhǎng)的多層試紙，包括a)一個(gè)底層，有一個(gè)接受樣品的直通孔；b)一個(gè)膜層，上有正對(duì)底層的樣品面和另一面為檢測(cè)面，膜層含有能與被分析物反應(yīng)發(fā)生變色的試劑，該試劑包括i)第一種成份，和被分析物作用形成過(guò)氧化氫；ii)第二種成份，和過(guò)氧化氫作用引起顏色變化，和iii)第三種成份，抑制第二種成份的變色；c)在膜層和底層之間的中間層；和d)沿試紙分布樣品的測(cè)量系統(tǒng)，由下列組成i)膜層中的非吸水區(qū)；和ii)在中間層形成的液體輸送通道，引導(dǎo)樣品從非吸水區(qū)的表面流向大量沿膜層長(zhǎng)度排列的分散的吸水檢測(cè)區(qū)；抑制劑濃度以一種預(yù)定方式從試紙樣端開(kāi)始增加，所以，如果變色有效的話，樣品中必須含有濃度相應(yīng)增長(zhǎng)的被分散物。當(dāng)樣品點(diǎn)到試紙上，一個(gè)或更多的檢測(cè)區(qū)會(huì)改變顏色，而離點(diǎn)樣端最遠(yuǎn)的變色區(qū)顯示了樣品中被分析物的濃度。
在操作方面，測(cè)量生物體液樣品中被分析物濃度的方法由下列步驟組成a)在試紙上點(diǎn)樣，該試紙包括i)多個(gè)吸水檢測(cè)區(qū)，該檢測(cè)區(qū)和至少含有一種預(yù)定量的被分析物的液體接觸時(shí)，每一個(gè)都變色，體液中被分析物的預(yù)定量大于靠近試紙點(diǎn)樣端的檢測(cè)區(qū)變色所需的被分析物的量，和ii)測(cè)量系統(tǒng)，該測(cè)量系統(tǒng)會(huì)使樣品和沿一種預(yù)定的非吸水路徑將樣品分布到每一個(gè)檢測(cè)區(qū)，以及b)觀察遠(yuǎn)離試紙點(diǎn)樣端的檢測(cè)區(qū)的顏色變化。
把含有被分析物的生物體液點(diǎn)到試紙的樣品面上后，試紙的種類(lèi)要能保證被分析物的濃度可以看到的顯示?？梢钥吹降娘@示出現(xiàn)在試紙的另一(或＂檢測(cè)＂)面上。
試紙的化學(xué)組成，當(dāng)然取決于所要測(cè)量的被分析物/生物體液。試紙可以被設(shè)計(jì)成能檢測(cè)血液、尿液和唾液等生物體液以及水中的葡萄糖或其它種糖、乙醇、膽固醇、蛋白質(zhì)、酮、尿酸、苯丙氨酸、或酶等被分析物。為方便和簡(jiǎn)捷，本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)比較詳細(xì)公開(kāi)的試紙能檢測(cè)血液中的葡萄糖。本領(lǐng)域的普技術(shù)人員根據(jù)本說(shuō)明書(shū)信息，很容易用于檢測(cè)其它被分析物/生物體液的組合物。
本發(fā)明的試紙?zhí)峁┮环N相對(duì)簡(jiǎn)單快速地測(cè)定待測(cè)血液樣品中葡萄糖濃度的方法。試紙包括一個(gè)有孔的底層，樣品可由該孔被引入到多孔基質(zhì)的樣品面上，樣品面的反面是檢測(cè)面。基質(zhì)通常為一種膜，在本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中這兩個(gè)術(shù)語(yǔ)可互換使用。檢測(cè)試劑結(jié)合到基質(zhì)上，或多或少地浸漬在基質(zhì)的微孔中。為簡(jiǎn)單起見(jiàn)，本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中基質(zhì)上的試劑稱(chēng)作＂包衣＂，以表示該試劑包衣滲透到基質(zhì)中。
中間層位于底層和基質(zhì)之間。中間層的切口沿膜的非吸水區(qū)排列，將樣品引入到排列在試紙上的一系列的吸水檢測(cè)區(qū)。(本申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)所述＂吸水的＂理解為＂有吸水性的。＂)檢測(cè)區(qū)周?chē)蜕戏娇臻g環(huán)繞一系列中間層的凹口，能使樣品流向這些區(qū)域。
這樣，把固定體積的樣品—一般為含有紅細(xì)胞和葡萄糖的全血—引向一系列檢測(cè)區(qū)的膜的每個(gè)樣品面。優(yōu)選地，底層具有和檢測(cè)區(qū)呈線性排列的出口孔，有利于樣品注入體積的均勻一致。由于基質(zhì)的多孔性，體液，例如通過(guò)毛細(xì)作用，從樣品面流向檢測(cè)面。這樣，檢測(cè)試劑能在檢測(cè)面上或附近與血液中的葡萄糖反應(yīng)而變色。由于紅細(xì)胞顏色較深，不利于檢測(cè)到顏色的變化，基質(zhì)優(yōu)選為各向異性的，微孔的直徑，從樣品面到檢測(cè)面逐漸由大到小，以使紅細(xì)胞從檢測(cè)區(qū)中分離出去。本發(fā)明試紙和計(jì)時(shí)劑的各和成份可用各種材料制成。這些材料已經(jīng)分別在公布1994年4月26日的美國(guó)專(zhuān)利5306623和1995年5月23日公布的美國(guó)專(zhuān)利5418142中公開(kāi)。
檢測(cè)試劑包括一種將葡萄糖轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的成份，例如是葡萄糖氧化酶；一種或幾種能檢測(cè)由存在于樣品中的葡萄糖生成物的過(guò)氧化氫的成份；和一種抑制劑。過(guò)氧化氫的檢測(cè)成份可以是過(guò)氧化酶，優(yōu)選為辣根過(guò)氧化酶，和一種在反應(yīng)過(guò)程中變色的＂指示劑＂。該指示劑可以是一種可氧化的染料或染料對(duì)。在過(guò)氧化氫存在的條件下，過(guò)氧化酶催化指示劑的氧化過(guò)程。檢測(cè)試劑的最后一種成份是能延遲指示劑氧化變色的抑制劑。
沿著試紙的長(zhǎng)度，可將其以這樣一種方式分割即膜的鄰近的節(jié)段中有不同的抑制劑濃度。每個(gè)節(jié)段有一個(gè)吸水檢測(cè)區(qū)，吸水檢測(cè)區(qū)變色的條件是，存在足夠的葡萄糖，首先消耗掉所有的抑制劑，然后才氧化指示劑，從而導(dǎo)致特征顏色的改變。這樣，在一個(gè)特定的檢測(cè)區(qū)中的變色顯示出最初血液樣品的葡萄糖濃度范圍。沿一特定方向，試紙每一連續(xù)的節(jié)段上，抑制劑濃度逐步增大，對(duì)應(yīng)于葡萄糖的濃度范圍也逐步增加。所有的節(jié)段上，指示劑的濃度是相同的。原則上講，其它各種抑制劑/指示劑配比也是可能的。
如果對(duì)某一特定試樣，節(jié)段具有在適宜范圍內(nèi)的抑制劑濃度相鄰的檢測(cè)區(qū)和被分析物反應(yīng)，那么一個(gè)檢測(cè)區(qū)變色而相領(lǐng)區(qū)不變色。結(jié)果表明，樣品中的葡萄糖濃度和該區(qū)變色所需的閾濃度相同，而不大于鄰近區(qū)變色所需的濃度范圍。
在血糖監(jiān)測(cè)中，可選的計(jì)時(shí)劑片段包衣包括了指示劑試紙的成份—一種多孔基質(zhì)，檢測(cè)試劑包覆其上—除了葡萄糖之外。干燥狀態(tài)下，試劑的化學(xué)性不能被葡萄糖激活，而當(dāng)樣品點(diǎn)到試紙上，使計(jì)時(shí)劑包衣水化，包衣中的葡萄糖在預(yù)定時(shí)間后使指示劑變色。葡萄糖最好是以大大超過(guò)克服抑制劑作用所需的量存在于計(jì)時(shí)劑中。在這種情況下，所需時(shí)間的長(zhǎng)或短取決于抑制劑的多或少?？芍苯油ㄟ^(guò)肉眼，或者可借助檢測(cè)反射值變化的光學(xué)儀器觀察試紙中的變色和計(jì)時(shí)劑中的變色。


圖1是本發(fā)明直接讀取結(jié)果的試紙基質(zhì)的透視圖。
圖2是本發(fā)明直接讀取結(jié)果的試紙的樣品面的底平面截面圖。
圖3是圖2的試紙內(nèi)部延伸的不連續(xù)的透視圖，局部截切。
圖4是圖2的試紙沿A-A線的截面圖。
圖5是本發(fā)明試紙的底平面圖。
圖6是頂平面圖，顯示圖5試紙的檢測(cè)面。
圖7是圖6點(diǎn)樣后的試紙。
本發(fā)明是一種測(cè)量生物體液中被分析物濃度的可直接讀取結(jié)果的試紙。試紙的主要成份是一種結(jié)合有檢測(cè)試劑的多孔基質(zhì)，試劑隨著點(diǎn)到試紙上的生物體液樣品中的被分析物而發(fā)生變色。
該基質(zhì)可以是一種均一的組合物，或者是一種有包覆層的酶作用物，基質(zhì)可以是各向同性的，也可以是各向異性的。基質(zhì)有一個(gè)樣品面，樣品點(diǎn)到樣品面上，還有一個(gè)可進(jìn)行變色觀測(cè)的檢測(cè)面，基質(zhì)優(yōu)選為一各向異性膜；更優(yōu)選地，各向異性膜有一較寬的微孔孔經(jīng)范圍。例如，膜微孔孔經(jīng)梯度從約0.1微米到約150微米。在微孔較大的一側(cè)，孔經(jīng)優(yōu)選范圍為約30微米至約40微米。在膜的微孔最小的一側(cè)，空隙體積相對(duì)較小，膜材料在一層內(nèi)一般相當(dāng)稠密，典型的情況是構(gòu)成直至膜厚度的20％。在這層內(nèi)，微孔孔經(jīng)優(yōu)選范圍為約0.1微米至0.8微，其公稱(chēng)尺寸優(yōu)選為約0.3微米。生物體液點(diǎn)到樣品面上后，樣品在透過(guò)膜時(shí)遇到孔徑越來(lái)越小的微孔。最后，例如紅細(xì)胞等的固形物在到達(dá)膜的某一位置后就不能再進(jìn)一步透過(guò)了。余下的樣品，包含了溶解的葡萄糖，繼續(xù)透過(guò)到達(dá)檢測(cè)面。膜的各向異性和/或分離成份的使用(下文將要述及)相對(duì)加快了透過(guò)膜的流速，即使同時(shí)伴隨著固形物的過(guò)濾。
樣品通過(guò)基質(zhì)時(shí)，和試劑的反應(yīng)使光吸收、染料在檢測(cè)面附近的空隙體積中形成或分解，從而實(shí)際上影響了基質(zhì)的反射能力。
基質(zhì)材料的適宜例子是聚砜類(lèi)和聚酰胺類(lèi)(尼龍類(lèi))。有類(lèi)似性質(zhì)的其它聚合物也同樣適用。聚合物可以經(jīng)修飾引入其它功能基，而具有荷電結(jié)構(gòu)，使基質(zhì)的表面可以是中性、陽(yáng)性或陰性。
制備形成基質(zhì)的多孔材料的優(yōu)選方法是在聚合物中不加入載體核。這種基質(zhì)，舉例來(lái)說(shuō)，是由Timonium，MD，Memtec公司生產(chǎn)的各向異性聚砜膜。通常選用厚度小于200微米的基質(zhì)，優(yōu)選為115至155微米。尤其基質(zhì)是尼龍或各向異性聚砜時(shí)，厚度更優(yōu)選為130至140微米。
將膜浸入檢測(cè)試劑的混合成份中，對(duì)膜進(jìn)行飽和處理。優(yōu)選地，至少一些成份相繼加入到膜中。過(guò)量的試劑可用機(jī)械方法除去，如空氣刀、刮刀或玻璃棒。然后將膜干燥。試劑往往會(huì)在膜的微孔較小的(檢測(cè))面富集。
檢測(cè)試劑包括(i)將葡萄糖轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的成份，(ii)檢測(cè)過(guò)氧化氫的成份，和(iii)過(guò)氧化氫檢測(cè)成份的抑制成份。可選地，試劑進(jìn)一步包括一種分離成份，分離成份可使固形物如紅細(xì)胞從基質(zhì)中誘離，有效地從生物體液中除去固形物。此外，下文和實(shí)施例中還將描述其它成份。
將葡萄糖轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫的成份優(yōu)選為葡糖氧化酶，它通常從黑曲霉或青霉屬中得到。葡糖氧化酶與葡萄糖和氧反應(yīng)，產(chǎn)生葡糖酸內(nèi)酯和過(guò)氧化氫。
最適宜的葡萄糖氧化酶濃度依據(jù)指示劑系統(tǒng)的組成而定。例如，如果指示劑系統(tǒng)是MBTHSB-ANS(具體描述見(jiàn)下文)，那么，葡糖氧化酶濃度范圍約500-1000V./ml是合適的，更優(yōu)選約700-2000V./ml，最優(yōu)選約1000V./ml。一般來(lái)說(shuō)，葡糖氧化酶的濃度越高，反應(yīng)進(jìn)行得越快，濃度越低，進(jìn)行得越慢。
這樣產(chǎn)生的過(guò)氧化氫與用于檢測(cè)過(guò)氧化氫的成份發(fā)生反應(yīng)，反應(yīng)中包括有一種過(guò)氧化物酶，它能有選擇性地催化過(guò)氧化氫與一種指示劑之間的反應(yīng)，過(guò)氧化物酶用過(guò)氧化氫作為一種能或從各種基質(zhì)上轉(zhuǎn)移氫原子的氧化劑。合適的過(guò)氧化物酶可以是正鐵血紅素，這是一種從植物中得到的氯高鐵血紅素。合適的過(guò)氧化物酶也可從動(dòng)物身上得到，例如從動(dòng)物的甲狀腺中得到。把馬蘿過(guò)氧化物酶(HRPO)用于檢測(cè)過(guò)氧化氫的成份中的一種組分是特別優(yōu)選的。
最好由過(guò)氧化物酶催化的過(guò)氧化氫，能與指示劑直接或間接地反應(yīng)面生成或分解成一種指示劑染料，該指示劑染料能在預(yù)定的波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸收光。優(yōu)選的是，該指示劑染料強(qiáng)吸收處的波長(zhǎng)與檢測(cè)試劑強(qiáng)吸收處的波長(zhǎng)不同。指示劑被氧化后的最終產(chǎn)物可以是有色的、暗淺色的、或無(wú)色的，并可由此證明在基質(zhì)的測(cè)試面所產(chǎn)生的顏色變化。也就是說(shuō)，檢測(cè)試劑能通過(guò)一個(gè)有色區(qū)變白了或改變了顏色，或者一個(gè)無(wú)色區(qū)產(chǎn)生了顏色等方式來(lái)指示樣品中被分析物的存在。
本發(fā)明中有用的指示劑包括(a)結(jié)合有了3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)的3-甲基-2-鹽酸苯并噻唑啉酮腙(MBTH)；(b)結(jié)合有3，5-二氯-2-羥基苯磺酸(DCHBS)的MBTH；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)和5-氧代-1-(對(duì)磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP和N-(間甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)2，2′-聯(lián)氮基-二(3-乙基苯噻唑啉)磺酸(ABTS)(f)4AAP和4-甲氧基萘酚；(g)焦棓酚紅(PGR)；(h)溴焦棓酚紅(BPR)；(i)酸性綠25(AG)；或者(j)結(jié)合有8-苯胺基-1-萘磺酸銨的(ANS)[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺氮苯磺酸-鈉(MBTHSB)。MBTHSB-ANS是優(yōu)選的。關(guān)于MBTHSB-ANS的其它資料見(jiàn)1994年9月8日申請(qǐng)的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)302,575，并作為本文的參考資料。
抑制成份例如通過(guò)減少過(guò)氧化氫或者減少被氧化的指示劑，可減慢過(guò)氧化氫與指示劑之間的反應(yīng)。原則上，對(duì)于抑制劑的處理有幾種不同的方式。首先，抑制劑可與指示劑競(jìng)爭(zhēng)，并由此減慢指示劑發(fā)生顏色變化的速率。其次，抑制劑也可以是非競(jìng)爭(zhēng)性的，以便于在指示劑發(fā)生任何真正的顏色變化之前，所有抑制劑能被充分地消耗掉。其它的抑制劑的處理方式也是可能的。本發(fā)明中的抑制劑優(yōu)選非競(jìng)爭(zhēng)性的。
合適的抑制劑包括2，3，4-三羥基苯甲酸；丙桔酸；3，4-二羥基肉桂酸；3，4-二羥基苯甲醛；沒(méi)食子酸；5，6-二氨基尿嘧啶；抗壞血酸；和異抗壞血酸?？箟难崾莾?yōu)選的，但是，抗壞血酸在溶液中容易被氧化，為了能把試劑包裹必須使抗壞血酸穩(wěn)定。優(yōu)選的穩(wěn)定劑是伯醇，如乙醇、甲酸、或丙醇。乙醇是優(yōu)選的，特別是其濃縮液，即50％或50％以上的乙醇溶液。
盡管優(yōu)選的基質(zhì)—各向異性膜可過(guò)濾紅細(xì)胞并阻止它們滲入檢測(cè)面，任選的檢測(cè)試劑也可含有一種分離成份。這種分離成份應(yīng)該能夠通過(guò)將紅細(xì)胞螯合到基質(zhì)上由含有紅細(xì)胞的液體如全血中產(chǎn)生一種相對(duì)透明無(wú)色的液體。本發(fā)明中使用的分離成份包括但不局限于PH值約4.0-8.0之間的聚乙二醇，聚(甲基·乙烯基醚/馬來(lái)酐)，聚丙二醇，聚苯乙烯磺酸，聚丙烯酸，聚乙烯醇，和聚乙烯磺酸。這些存在于基質(zhì)中的分離成份的量將根據(jù)它們的電荷及分子量、嵌鑲在基質(zhì)上的其它成份，基質(zhì)的PH值及孔徑大小，以及基質(zhì)干燥后的殘留水分等因素而變化。這些參數(shù)很容易由公眾熟知的方法來(lái)測(cè)定。例如，當(dāng)使用聚丙二醇作為分離成份(如BASF，Wyandotte，MI的PPG-410)時(shí)，其優(yōu)選的重量體積比(W/V)為約2-30％，更優(yōu)選8-10％(W/V)。使用其它的分離成份時(shí)也可采用濃度約2-30％W/V的。在生產(chǎn)過(guò)程中，聚合的分離成份可以被浸漬或嵌鑲到基質(zhì)上或者鑄造到膜上。
某些水溶性的鹽也能影響血液的分離。適于分離血液成份的鹽包括檸檬酸鹽、甲酸鹽、硫酸鹽。也可以是某種酸，如氨基酸，檸檬酸、肌醇六磷酸和馬酸。(參見(jiàn)，例如MC Fetter G8 1971年1月5日公布的U.S.Pat.3,552,928)加入分離成份的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是象紅細(xì)胞這樣的固體能被大部分從生物液體中分離出來(lái)，使測(cè)試部位的背景顏色很淺，而由檢測(cè)試劑產(chǎn)生的顏色上的變化則變得清晰。
其它的成份也可以被嵌鑲到基質(zhì)上以增強(qiáng)試劑帶的顯色反應(yīng)和清晰度，并使基質(zhì)保持均勻和完整。例如，檢測(cè)試劑可含有鹽和/或緩沖劑以有助于基質(zhì)中染料的分離。這樣的緩沖劑可以是，例如以約0.01M到1.0M優(yōu)選約0.1M的存在的檸檬酸溶液。也可使用其它的緩沖劑。
也可使用使基質(zhì)親水的化合物或能用作穩(wěn)定劑的化合物，如水解蛋白。這樣的化合物包括但不局限于例如牛血清白蛋白，多肽和象Crotein SPA(CRODAInc.New York，N.Y.)這樣可獲及的低分子量蛋白。這些化合物在使用時(shí)的濃度可以約1mg/ml到約100mg/ml。在使用Crotein時(shí)，優(yōu)選約30mg/ml。
其它的穩(wěn)定劑和防腐劑也可以被包括在用于基的涂層中。例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和一些相關(guān)的化合物也可以。例如約0.01mg/ml到約10mg/ml的濃度使用。使用防腐劑的目的之一是幫助穩(wěn)定抑制劑。
有一些指示劑(如BPR)在基質(zhì)中具有一種遷移的不理想的傾向。當(dāng)使用這樣的指示劑時(shí)，可加入一種離子對(duì)試劑以防止這種遷移。例如，象Polyquart(H)(Henkel，Inc，Ambler，PA)這樣的可買(mǎi)到的聚乙二醇衍生物尤為適用，因?yàn)樗鼈兡苡兄谠谥甘緞┡c其它的基質(zhì)取代基之間形成離子對(duì)。
當(dāng)被分析物的存在以顯色的方式(如MBTHSB-ANS)顯示時(shí)，可以加入一種表面活性劑以加深顏色和增強(qiáng)與未顯色的背景之間的對(duì)比度。
本發(fā)明中也可以使用有機(jī)溶劑，它可被包括在用于基質(zhì)的檢測(cè)試劑配方中，當(dāng)然，前提是它們應(yīng)與基質(zhì)和檢測(cè)試劑的組分互容?？蛇m用的有機(jī)溶劑包括氯仿，丙醇、乙醇、二氯甲烷，乙酸乙酯和石油醚，乙腈以及它們的混合物。本發(fā)明中優(yōu)選70％的乙醇水溶液。
被涂敷到基質(zhì)上或浸漬到基質(zhì)中的檢測(cè)試劑在試紙的表面上是不均勻的。其實(shí)，試劑優(yōu)選以一系列平行帶或＂段＂順著試紙的狹長(zhǎng)范圍延伸的方式用于基質(zhì)中。相鄰段的組分中的有效抑制濃度逐漸增大。每個(gè)段有一個(gè)吸水的檢測(cè)區(qū)。正是在檢測(cè)區(qū)中，檢測(cè)試劑與血液中的葡萄糖反應(yīng)引起顏色變化，前提是葡萄糖的濃度大得能超過(guò)分析區(qū)中抑制劑的含量。這樣，為了使檢測(cè)區(qū)變色，每一個(gè)有效的分析區(qū)都需要樣品有一個(gè)逐漸增高的較大的葡萄糖濃度。
可任選一個(gè)檢測(cè)區(qū)適用作計(jì)時(shí)劑，以標(biāo)示試劑與葡萄糖在每一個(gè)檢測(cè)區(qū)中反應(yīng)所需的足夠時(shí)間已經(jīng)消逝。基質(zhì)的計(jì)時(shí)劑段可以組合物的形式涂敷或浸漬到基質(zhì)上，該組合物除含有檢測(cè)試劑外，還含有葡萄糖。由于檢測(cè)試劑的目的是與葡萄糖反應(yīng)而顯色，所以同時(shí)含有這兩種試劑而不產(chǎn)生顏色的變化需要加倍小心。必須含有超過(guò)計(jì)時(shí)功能所需量的抑制劑以補(bǔ)償這一效應(yīng)。在使用了含有葡萄糖的溶液后，要控制計(jì)時(shí)劑節(jié)段的干燥速率。實(shí)際上，首先把含有緩沖劑、穩(wěn)定劑和酶的溶液涂敷于膜上，將涂層干燥后形成第一層。然后，用含有指示劑、抑制劑和葡萄糖的溶液進(jìn)行第二次涂敷。象織物速率、爐溫和氣流、以及涂敷溶液沉淀的量等參數(shù)必須事先設(shè)定，并適當(dāng)調(diào)節(jié)抑制劑和/或葡萄糖的濃度。如果不直接形成第二涂層，也可另選一非最佳方案，即在一單獨(dú)的織物上制成第二涂層，然后將其置于第一涂層上。
當(dāng)樣品被點(diǎn)到試紙上時(shí)，計(jì)時(shí)劑節(jié)段組分被潤(rùn)濕使得顯色反應(yīng)得以進(jìn)行。然后通過(guò)溫度和檢測(cè)試劑的特性，尤其是抑制劑的濃度、葡萄糖的量、潤(rùn)濕速率及氧氣擴(kuò)散速率等來(lái)測(cè)定計(jì)時(shí)劑節(jié)段改變顏色所需的時(shí)間。
可使計(jì)時(shí)劑變色的時(shí)間依賴(lài)于樣品中的葡萄糖濃度，也可使其不依賴(lài)于樣品中的葡萄糖濃度。在計(jì)時(shí)劑節(jié)段中加入大大過(guò)量的葡萄糖，其變色時(shí)間就幾乎不依賴(lài)于樣品的葡萄糖濃度。而在計(jì)時(shí)劑節(jié)段中加入少量的葡萄糖，其變色時(shí)間就將依賴(lài)于樣品中的葡萄糖濃度，即如果樣品中的葡萄糖濃度越高，時(shí)劑改變顏色越快。優(yōu)選的是，計(jì)時(shí)劑中的葡萄糖濃度大于約1500mg/dl，這將使定時(shí)器幾乎不依賴(lài)于范圍在約40-400mg/dL之間的樣品中的葡萄糖濃度。計(jì)時(shí)劑節(jié)段的組分包括過(guò)量的將葡萄糖轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫的成份(如葡萄糖氧化酶)和過(guò)量的葡萄糖。那么，計(jì)時(shí)劑的組分中至少應(yīng)包括比具有最高抑制劑濃度的測(cè)試段相同、或更多的抑制劑(對(duì)應(yīng)于最高葡萄糖讀數(shù))。
計(jì)時(shí)劑也起著重要的質(zhì)量監(jiān)測(cè)作用，它可使試紙因暴露于潮濕環(huán)境而導(dǎo)致失效時(shí)明顯地顯示出來(lái)，試紙?jiān)谑褂们氨仨毐３指稍?，因?yàn)閷⑵咸烟寝D(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫的成份(通常是酶)在潮濕環(huán)境中容易降解。因此，如果試紙被過(guò)早地暴露于濕環(huán)境中，它將會(huì)失敗。如果試紙的損壞沒(méi)有被明顯地顯示出來(lái)，使用者可能不知它已損壞而使用了這樣的試紙就會(huì)得到錯(cuò)誤的結(jié)果。然而，如果包括有計(jì)時(shí)劑節(jié)段的試紙暴露于濕環(huán)境中引起計(jì)時(shí)劑的變色，這就會(huì)警告使用者注意該試紙已失效，就不會(huì)使用它了。
除了含有試劑的基質(zhì)外，本發(fā)明中的試紙還包括一個(gè)底層以支持基質(zhì)。該底層優(yōu)選熱塑塑料片，更優(yōu)選聚酯，并有一個(gè)孔把樣品點(diǎn)到基質(zhì)的樣品面。血液樣品從樣品孔沿著基質(zhì)的長(zhǎng)度分布。如果底層基本上是不透明的，那么，一個(gè)或更多透明的窗口部分可位于與樣品孔有一適當(dāng)距離的地方，樣品在窗口中的出現(xiàn)就可確證足夠的樣品已被點(diǎn)到試紙上了。
血液從樣品孔分布到檢測(cè)區(qū)還涉及到一個(gè)中間層，它位于底層和膜之間并任意地粘合到二者上。中間層優(yōu)選熱塑塑料片，更優(yōu)選聚酯。它是一個(gè)保險(xiǎn)裝置確保樣品順著試紙的長(zhǎng)度方向并沿著膜上的非吸水路徑直接到達(dá)每一個(gè)檢測(cè)區(qū)。在中間層上正對(duì)檢測(cè)區(qū)的位置處有一個(gè)凹口，以使每一個(gè)檢測(cè)區(qū)都絕大部分被中間層的壁所環(huán)繞。
膜上的非吸水路徑的結(jié)構(gòu)優(yōu)選通過(guò)破壞膜孔的結(jié)構(gòu)來(lái)形成。這可通過(guò)直接加熱或使用激光加熱或超聲波加熱的方法來(lái)完成，優(yōu)選在加壓的情況下進(jìn)行。然而，優(yōu)選的方法是粉碎。因此，除了檢測(cè)區(qū)部位，其它部位的膜都被粉碎以使它吸水(但仍是親水的)。對(duì)于本發(fā)明中優(yōu)選的膜，需要粉碎的區(qū)域優(yōu)選在高壓至少6tons/in2(80000KPa)和加熱(至少110℃)的條件下進(jìn)行粉碎。當(dāng)然，優(yōu)選的壓力和溫度依賴(lài)于粉碎過(guò)程及停留時(shí)間，也依賴(lài)于膜的參數(shù)。最佳值可由常規(guī)試驗(yàn)來(lái)測(cè)定。
為了精確測(cè)量，重要的一點(diǎn)是提供到每個(gè)檢測(cè)區(qū)中的血液的量可重復(fù)。如果缺口完全包圍住分析區(qū)，而且假定在中間層與底層及被粉碎的膜之間有一個(gè)不透液的密封部分，那么，每個(gè)分析區(qū)都將伴有一個(gè)閉合的體積(圓筒型的)，它的壁由中間層構(gòu)成，底由膜及底層構(gòu)成。然而，有一個(gè)分布通道沿著試紙伸展并將樣品送到每一個(gè)檢測(cè)區(qū)。高精度需要分布通道提供一個(gè)固定量的樣品到每個(gè)檢測(cè)區(qū)，但至少在約1或2分鐘的測(cè)量時(shí)間內(nèi)不再提供。由于初始樣品是可變的，因此優(yōu)選在每一個(gè)膜的底部有一個(gè)吸收層將過(guò)量的樣品從分布通道的底端帶走。在通道末端的吸收層也可促使樣品沿著試紙的長(zhǎng)度方向吸水上升。優(yōu)選由公眾熟知方法制成的非織造織物構(gòu)成吸收層。
出現(xiàn)在膜的測(cè)試面測(cè)試樣品中的葡萄糖引起顏色的改變。在膜的測(cè)試面上覆蓋一個(gè)有孔的上層是很簡(jiǎn)單的，這個(gè)孔是與檢測(cè)區(qū)對(duì)齊的。通過(guò)該孔可看到顏色的改變，并且可使氧氣到達(dá)反應(yīng)點(diǎn)。上層可以用粘合劑附著到膜上。如果粘合劑會(huì)干撓葡萄糖檢測(cè)反應(yīng)，那么優(yōu)選將其限制于膜的非吸水區(qū)。然而，如果粘合劑不會(huì)干撓反應(yīng)，則對(duì)它的位置沒(méi)有苛求。
由于含有優(yōu)選試劑的檢測(cè)區(qū)暴露于光或氧氣中會(huì)緩慢變色，任選的計(jì)時(shí)劑對(duì)潮濕環(huán)境敏感，因此試紙優(yōu)選用不透氧和水的材料密封包裝，例如用錫箔紙密封包裝。如果試紙是單獨(dú)包裝的，使用時(shí)它也可以保留在一個(gè)可剝開(kāi)的外殼中。
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。圖1所示為本發(fā)明中用于測(cè)定生物體液中被分析量的基質(zhì)10。盡管是以拱形位置顯示的，但基質(zhì)10是易揉曲的，并且使用時(shí)通常為平面?；|(zhì)包括一個(gè)可將生物體液樣品點(diǎn)在上面的樣品面12，和一個(gè)測(cè)試面14，在其上或附近的顏色變化將指示被分析物的存在。變色是被分析物與浸漬在孔16中的試劑相互反應(yīng)的結(jié)果。優(yōu)選在測(cè)定血液中葡萄糖濃度時(shí)，靠近樣品面12的孔徑相對(duì)較大，靠近測(cè)試面14時(shí)逐漸減小。孔徑梯度變化是用來(lái)阻止紅細(xì)胞靠近樣品面12，以便它們的顏色不會(huì)妨礙對(duì)指示被分析物存在的顏色變化的可見(jiàn)能力。
三個(gè)平行段a，b和c如圖所示。每個(gè)有效段中含有的抑制劑依次增加。在優(yōu)選的方案中，當(dāng)試劑被點(diǎn)到平行段中的膜上后，如圖所示，除了發(fā)生被分析物與試劑反應(yīng)的檢測(cè)區(qū)外，其它部位的膜被粉碎。位于每個(gè)平行段中的單獨(dú)吸水區(qū)和被粉碎的非吸水區(qū)的模式將在圖2的平面圖與圖3的片斷放大的透視圖中顯示。
圖2是局部切去一角后，膜10的樣品面12和被中間層24及底層26覆蓋的吸收層20和22的底平面圖。膜10和吸收層20和22優(yōu)選由頂層支持，頂層在圖中沒(méi)有顯示。吸收層20和22優(yōu)選在膜的底端(超出虛線A和B)以吸收比設(shè)定所需的過(guò)量血液樣品。測(cè)定時(shí)的樣品量必須能足夠提供到每個(gè)檢測(cè)區(qū)和計(jì)時(shí)區(qū)(如果有的話)。一般來(lái)說(shuō)，檢測(cè)區(qū)越少的試紙不需要太多的樣品，但葡萄糖測(cè)定值的范圍也越窄且/或越不精確。圖2所示的9個(gè)吸水區(qū)，相當(dāng)于8個(gè)檢測(cè)區(qū)(標(biāo)示1-8)和一個(gè)計(jì)時(shí)區(qū)(T)，在不需要不可接受的大樣品量的情況下，就可提供足夠的測(cè)試范圍和精度。中間層24有一個(gè)凹口28，它與底層26上的樣品孔30對(duì)齊。樣品由樣品孔30加入后通過(guò)毛細(xì)作用直接沿著中間層24上的中心通道32到達(dá)每個(gè)檢測(cè)區(qū)和計(jì)時(shí)區(qū)，任何過(guò)量的樣品都會(huì)被吸收層20和22吸收。樣品在任選的透明窗口34和35中的出現(xiàn)可確保已提供了足夠的樣品用于測(cè)定。優(yōu)選的是，中間層24與膜的樣品面12之間形成一個(gè)密封區(qū)，以便樣品不能在相鄰的兩個(gè)檢測(cè)區(qū)之間直接流動(dòng)。
圖3是一個(gè)放大的片斷透視圖，圖中表示有透過(guò)底層26可見(jiàn)的3個(gè)檢測(cè)區(qū)6、7和8，它們被中間層24的指狀突出部分分隔開(kāi)。任何粘合劑層24A把中間層24和底層26及膜10粘結(jié)在一起。在層26上有一個(gè)通風(fēng)孔40以有助于樣品在試紙上流動(dòng)。在頂層36上對(duì)準(zhǔn)吸水區(qū)的孔如38，使得在吸水區(qū)的任何顏色變化都是可見(jiàn)的，并可使顯色反應(yīng)所需的氧進(jìn)入。任何粘合劑層36A將頂層36與膜10的測(cè)試面粘結(jié)在一起。
圖4是沿著圖2中的線4-4所做的截面圖，除了顯示有在圖2中顯示的層外，還顯示了頂層36。底層26上的通網(wǎng)孔如40與檢測(cè)區(qū)及計(jì)時(shí)區(qū)對(duì)準(zhǔn)以幫助樣品填充到每個(gè)區(qū)的周?chē)?。填充的樣品被限制在?0、中間層24和底層26之中。注意，檢測(cè)區(qū)3的底部與底層26之間的間隙大約只有12微米，但為了清楚起見(jiàn)，圖中顯示了較大的尺度。
圖5是本發(fā)明中試紙的底平面圖，顯示了樣品孔30和使用者直接通過(guò)此孔進(jìn)樣的圖示。當(dāng)通過(guò)透明窗口34和35看到樣品時(shí)，就確認(rèn)有足夠的樣品已被點(diǎn)到試紙上。
圖6是試紙頂層36的平面圖，與葡萄糖濃度有關(guān)的檢測(cè)區(qū)已被校正過(guò)。
圖7所示為血液樣品被點(diǎn)到圖6的試紙的孔30(圖2)中后，樣品沿著中心通道32擴(kuò)展，樣品中的葡萄糖與檢測(cè)區(qū)中的試劑發(fā)生反應(yīng)。由于最下面的檢測(cè)區(qū)中的抑制劑最少，它將首先改變顏色。然后，第二個(gè)，第三個(gè)分析區(qū)變色。因?yàn)闃悠分械钠咸烟翘?，上面的檢測(cè)區(qū)沒(méi)有變色。由于使計(jì)時(shí)區(qū)42變色的足夠時(shí)間已經(jīng)過(guò)去，所以可讀取結(jié)果。因此，在圖7中表示的結(jié)果顯示了樣品葡萄糖濃度至少為120mg/dL，但小于150mg/mL。在計(jì)時(shí)區(qū)42變色后的任何時(shí)間內(nèi)都可讀數(shù)。注意，在圖7中顯示的由試劑與葡萄糖反應(yīng)引起的顏色變化是從無(wú)色變?yōu)橛猩?。然而，系統(tǒng)也可改變對(duì)被葡萄糖誘導(dǎo)氧化而破壞的染料指示劑的處理方式，與之相對(duì)應(yīng)的顏色變化是從有色變?yōu)闊o(wú)色。
為了更好地理解本發(fā)明，下面的實(shí)施例將進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的各種不同的方案。但實(shí)施例并非是以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定的。
實(shí)施例1-BPR指示劑制備下列溶液蒸餾水 83.5g1％(W/W)EDTA Na223.8g烏頭酸 6.0gNaOH(固體) 2.2gCrotein SPA 4.2g咪唑 0.6g甘露糖醇 3.0g5％(W/W)Surfactol Q1 3.0g調(diào)PH值到4.80乙醇40.0gPPG-410 5.6g酶溶液 28.0g酶溶液0.2M烏頭酸 27.0g葡萄糖氧化酶 165,000UHRPO 340,000U把Memtec BTSH 55膜浸入上述溶液中進(jìn)行涂敷并用玻璃棒除去過(guò)量試劑。在180F及中速氣流條件下把涂敷后的膜在浮選干燥器中進(jìn)行干燥，以使織物在20秒內(nèi)充分干燥。把織物卷起進(jìn)行下文所述的第二次涂敷。制備下列溶液抗壞血酸(抑制劑)原料溶液 稀釋劑蒸餾水190g370g1％EDTA Na255g107gBPR 0.36g 0.71gPoly QuartH 6g 11.8gPPG-410 14.2g 27.8g抗壞血酸 1.37g-乙醇 243g 477g計(jì)時(shí)劑溶液稀釋劑(根據(jù)上述配方) 120g抗壞血酸0.885g葡萄糖溶液*17.25g*該葡萄糖溶液為16.0g/dL的葡萄糖水溶液，并使其變旋24小時(shí)，冷凍保藏。
按下列比例將原料溶液稀釋0.0405∶1，0.108∶1，0.236∶1，0.369∶1，0.569∶1，1.260∶1。這些逐漸升高的抑制劑濃度對(duì)應(yīng)于檢測(cè)區(qū)反應(yīng)的逐漸加大的葡萄糖濃度。把這些溶液和計(jì)時(shí)劑溶液一齊涂敷到含有酶的膜的大孔面上，并使其以每平方毫米的1.2×10-4ml的速度沉積到膜上。在把膜進(jìn)行與上酶涂層相同條件下的干燥之前先將其潤(rùn)濕約15秒。結(jié)果顯示計(jì)時(shí)劑反應(yīng)變色時(shí)間在64秒到79秒之間，其中約95％是在約70秒。
實(shí)施例2-MBTHSB-ANS指示劑制備下列溶液HPLC水 1500ml檸檬酸 16.92g檸檬酸鈉20.88g甘露糖醇 15gEDTA Na21.26gGantrez S95 6.75gCrotein SPA36g葡萄糖氧化酶 1.6g MUHRPO 1.5MUCarbopol 910*75ml檸檬酸二鈉**225ml*11％的乙腈溶液**0.1M，PH5.0在一個(gè)長(zhǎng)槽中涂敷Memtec BTS 35膜以使其大孔面接觸涂層溶液，過(guò)量的溶液用玻璃棒去除。同實(shí)施例1，把膜干燥后卷起。
制備下列溶液溶液A(指示劑) 溶液B(潤(rùn)濕劑)70％(V/V)乙醇2819ml Maphos60A41gMBTHSB 2.98g70％(V/V)乙醇 205ml(NH4)ANS25.83g溶液B205ml2％DTPA 51.25ml溶液(抗壞血酸鹽原料)水 115ml抗壞血酸 4.58g乙醇 267ml
溶液D(計(jì)時(shí)劑)水 53ml抗壞血酸 8.75g乙醇 123ml用70％乙醇調(diào)體積到175ml葡萄糖溶液 40.5ml對(duì)于每份抑制劑溶液而言，溶液A的體積都固定為263ml。對(duì)于不同的檢測(cè)區(qū)，70％EtOH與溶液C的體積比從58.9變化為0.200，對(duì)所有抑制劑溶液來(lái)說(shuō)，把70％EtOH+溶液C加入溶液A后的體積為87.5ml。這樣僅有效地改變每份溶液中抑制劑的濃度。把含有濃度逐漸升高的抑制劑溶液和計(jì)時(shí)劑溶液(溶液D)一齊涂敷到膜的大孔面。調(diào)節(jié)沉積速率使每平方毫米膜上沉積～8×10-5ml抑制劑。按上述方法將膜干燥，但在涂敷與干燥間停留約1.6分鐘。結(jié)果表明計(jì)時(shí)劑約在60秒內(nèi)與血液中30％到55％的血細(xì)胞比容或78到420mg/dL的葡萄糖對(duì)此幾乎沒(méi)有影響。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白以上描述和實(shí)施例是用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施，但不是以任何方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限定的。在本發(fā)明的構(gòu)思及保護(hù)范圍內(nèi)仍可作出本文所述的各種詳細(xì)的實(shí)施方式。
權(quán)利要求
1.一種用于測(cè)量點(diǎn)在其上的生物體液樣品中被分析物濃度的延長(zhǎng)多層試紙，它包括a)一個(gè)底層，上有接受樣品的直通孔；b)一個(gè)膜層，上有正對(duì)底層的樣品面，相反的另一面為檢測(cè)面，膜層含\有能與被分析物反應(yīng)發(fā)出變色的試劑，該試劑包括i)第一種成份，和被分析物作用形成過(guò)氧化氫；ii)第二種成份，和過(guò)氧化氫作用發(fā)生顏色變化；和iii)第三種成份，抑制第二種成份的變色；c)介于膜層和底層之間的中間層；和d)沿試紙分布樣品的測(cè)量系統(tǒng)，它包括i)膜層中的非吸水區(qū)；和ii)在中間層形成的液體輸送通道，引導(dǎo)樣品從非吸水區(qū)的表面流向沿膜層長(zhǎng)度排列的多個(gè)分散的吸水檢測(cè)區(qū)；抑制劑濃度以一種預(yù)定方式從試紙點(diǎn)樣端開(kāi)始增加，所以，如果影響變色的話，在樣品必須含有相應(yīng)增加的分析物的濃度；當(dāng)樣品點(diǎn)到試紙上時(shí)，一個(gè)或多個(gè)檢測(cè)區(qū)可以改變顏色，而離點(diǎn)樣端最遠(yuǎn)的變色區(qū)顯示了樣品中被分析物的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的被分析物是葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的生物體液是血液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的底層包括熱塑片。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的試紙，所述的底層包括聚酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的底層還包括大量呈線性排列在檢測(cè)區(qū)的直通孔。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的底層有一層透明部分，它位于離樣品接受孔預(yù)定距離的位置，以保證適當(dāng)?shù)臉悠妨俊?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的膜層是由一各向異性的多孔膜組成，膜的樣品面附近的微孔稍大，在檢測(cè)面附近為微孔稍小。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的試紙，所述的微孔選用了一定的孔徑，以使全血樣品的紅細(xì)胞在膜中誘離。
10.根據(jù)權(quán)利要求8的試紙，所述的膜是由聚砜組成的。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述第一種成分是由葡萄糖氧化酶組成的。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的第二種成分是由一種過(guò)氧化酶和一種被氧化后變色的染料或染料對(duì)指示劑組成的。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的試紙，所述的過(guò)氧化酶是辣根過(guò)氧化酶。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的試紙，所述的染料或染料對(duì)指示劑是MBTHSB-ANS。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的第三種成分是由抗壞血酸組成的。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的試劑中還包括一種分離成份，它選自聚乙二醇，聚(甲基乙烯基醚/馬來(lái))酸酐，聚丙二醇，聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙烯磺酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的中間層是由一種熱塑片組成的。
18.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的中間層是由聚酯組成。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，所述的吸水和非吸水區(qū)分別由膜層有非粉碎區(qū)和粉碎區(qū)組成。
20.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，還包括一個(gè)頂層，該頂層和膜層的上表面接觸，上有呈線性排列在檢測(cè)區(qū)的直通孔。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的試紙，所述膜層粘附到頂層。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的試紙，所述的膜層用一種粘合劑粘附到頂層，該頂層被限制在膜層的非吸水區(qū)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，它還包括吸收層，該吸收層與膜的各端連接。
24.根據(jù)權(quán)利要求1的試紙，它還包括一種計(jì)時(shí)劑成份，該成份組成一種檢測(cè)區(qū)，該檢測(cè)區(qū)除這種試劑外還包括一定量的葡萄糖，在樣品點(diǎn)到試紙上的預(yù)定時(shí)間后，使檢測(cè)區(qū)變色。
25.一種測(cè)量生物體液樣品中被分析物濃度的方法，它由下列步驟組成a)在一種試紙上點(diǎn)樣，該試紙包括i)多個(gè)吸水檢測(cè)區(qū)，該檢測(cè)區(qū)和至少含有一種預(yù)定量的被分析物接觸時(shí)，每個(gè)檢測(cè)區(qū)都會(huì)變色，體液中被分析物的預(yù)定量要大于靠近試紙點(diǎn)樣端的檢測(cè)區(qū)變色所需的被分析物的量，和ii)測(cè)量系統(tǒng)，該測(cè)量系統(tǒng)會(huì)使樣品沿著一種預(yù)定的非吸水區(qū)路徑分布到每個(gè)檢測(cè)區(qū)，和b)觀察遠(yuǎn)離試紙點(diǎn)樣端的檢測(cè)區(qū)的顏色變化。
全文摘要
一種測(cè)量點(diǎn)在其上的生物體液樣品中被分析物濃度的多層試紙。它是把樣品引到排列在試紙上的許多檢測(cè)區(qū)，被分析物與試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色變化。每個(gè)檢測(cè)區(qū)中還包括一種變色反應(yīng)的抑制劑。該抑制劑的濃度在連續(xù)的檢測(cè)區(qū)中逐漸增加，因此，變色的檢測(cè)區(qū)的數(shù)就是被分析物濃度的度量。該試紙尤其用于測(cè)量全血樣品中的葡萄糖濃度。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，樣品是沿著膜的粉碎區(qū)形成的路徑進(jìn)入檢測(cè)區(qū)，檢測(cè)區(qū)是膜的非粉碎區(qū)。
文檔編號(hào)G01N21/77GK1156251SQ96112158
公開(kāi)日1997年8月6日 申請(qǐng)日期1996年8月3日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月3日
發(fā)明者J·道格拉斯, M·F·托馬斯科, E·吉澤, R·達(dá)托, E·G·萊斯, D·P·圖希, M·馬克森 申請(qǐng)人:生命掃描有限公司