本發(fā)明涉及細(xì)胞檢測(cè)，尤其涉及一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)胞是組成生命的基本單元，主要由蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等分子構(gòu)成，不同細(xì)胞以及相同細(xì)胞不同發(fā)育階段存在分子成分及含量差異，例如在細(xì)胞癌變的過(guò)程中通常存在代謝差異。拉曼光譜是分子散射光譜，可以反映分子共價(jià)鍵本征振動(dòng)信息，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞拉曼光譜，獲取細(xì)胞的分子種類和含量信息。單細(xì)胞拉曼光譜技術(shù)具有無(wú)標(biāo)無(wú)損的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，在細(xì)胞鑒別、癌癥診斷、癌癥預(yù)后判斷等領(lǐng)域具有潛在應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)與顯微鏡聯(lián)用，將分析樣本置于顯微鏡下，由顯微鏡將拉曼激發(fā)光斑聚焦在細(xì)胞上，激發(fā)細(xì)胞拉曼信號(hào)后由物鏡收集，將散射信號(hào)傳輸至光譜儀中獲取細(xì)胞拉曼光譜，用于后續(xù)的分析。

2、現(xiàn)有的拉曼顯微分析系統(tǒng)中，依靠白光顯微鏡來(lái)尋找和定位細(xì)胞，尋找激發(fā)的位置。但是細(xì)胞是一個(gè)空間三維結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞空間形態(tài)各異，不同結(jié)構(gòu)具有顯著的成分差異。顯微物鏡將拉曼激發(fā)光聚焦的光斑尺寸通常小于細(xì)胞尺寸，并且傳統(tǒng)顯微鏡獲取的是細(xì)胞中某一層的平面結(jié)構(gòu)圖像，通過(guò)振鏡或者平移臺(tái)將細(xì)胞樣品置于聚焦光斑位置上來(lái)進(jìn)行水平方向（橫向）定位。在水平方向，細(xì)胞輪廓與外部環(huán)境有較為清晰的邊界，可以輔助細(xì)胞定位，但是在顯微鏡光軸方向，通過(guò)檢測(cè)人員手動(dòng)調(diào)節(jié)顯微鏡焦距來(lái)對(duì)細(xì)胞不同層進(jìn)行成像和軸向（縱向）定位，細(xì)胞內(nèi)部是近乎透明的樣本，染色、增加熒光標(biāo)記的方法均會(huì)破壞拉曼光譜無(wú)標(biāo)記檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，染料、熒光標(biāo)記物的信號(hào)均會(huì)對(duì)樣本拉曼光譜造成干擾，乃至無(wú)法進(jìn)行拉曼光譜檢測(cè)。在不標(biāo)記、不染色的情況下，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)比度低，細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)對(duì)比度低，各層之間的差別幾乎不能分辨，

3、因此常規(guī)拉曼檢測(cè)不能有效分辨軸向即不同層面上激光光斑聚焦位置，軸向分辨率低，僅僅只能依靠實(shí)驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判斷，導(dǎo)致細(xì)胞拉曼激發(fā)光斑軸向定位精度低，激發(fā)光譜的一致性無(wú)法保障，在后續(xù)的分析中引入采樣誤差，導(dǎo)致當(dāng)前整體技術(shù)分析精度下降。目前尚沒(méi)有無(wú)標(biāo)記、不染色、客觀、定量的進(jìn)行細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)軸向定位的方法，用于保證細(xì)胞拉曼光譜軸向采樣的一致性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為解決上述問(wèn)題，提供一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法。

2、本發(fā)明目的在于提供一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，具體包括如下步驟：

3、s1.選擇拉曼光譜存在差異的兩種不同材質(zhì)的玻片，分別作為載玻片和蓋玻片；通過(guò)測(cè)試，分別得到載玻片和蓋玻片的歸一化標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜；

4、s2.將待測(cè)細(xì)胞樣本固定于載玻片和蓋玻片中間，制成檢測(cè)樣本；將檢測(cè)樣本放置于顯微物鏡之下，在普通白光照明下調(diào)節(jié)焦距，尋找目標(biāo)細(xì)胞位置；

5、s3.找到目標(biāo)細(xì)胞后，將光源切換為激光，在細(xì)胞樣本上形成激發(fā)拉曼信號(hào)的聚焦光斑，檢測(cè)此時(shí)樣本的拉曼光譜；

6、s4.利用回歸算法求解出蓋玻片和載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，構(gòu)造相關(guān)線性方程組，計(jì)算得到細(xì)胞樣本的拉曼光譜；

7、s5.根據(jù)蓋玻片和載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，構(gòu)造光斑軸向的歸一化定位系數(shù)；

8、s6.構(gòu)建判別模型；將已知類型細(xì)胞樣本采集得到的拉曼光譜作為訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫(kù)，訓(xùn)練判別模型；用訓(xùn)練好的判別模型對(duì)待測(cè)細(xì)胞樣本進(jìn)行判別，得到判別結(jié)果。

9、優(yōu)選的，步驟s4中的回歸算法為最小二乘法；細(xì)胞樣本的拉曼光譜的表達(dá)式如下：

10、；

11、式中，s為檢測(cè)得到的測(cè)試總和拉曼光譜，s1、s2分別為蓋玻片和載玻片的歸一化標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜，a1、a2分別為檢測(cè)時(shí)蓋玻片和載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，r為細(xì)胞樣本的拉曼光譜。

12、優(yōu)選的，蓋玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)a1或載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)a2的取值最小為0。

13、優(yōu)選的，步驟s4中相關(guān)線性方程組表達(dá)式如下：

14、；

15、式中，s為檢測(cè)得到的測(cè)試總和拉曼光譜，s1、s2分別為蓋玻片和載玻片的歸一化標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜，a1、a2分別為檢測(cè)時(shí)蓋玻片和載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，r為細(xì)胞樣本的拉曼光譜，ωi為拉曼頻移，n為拉曼光譜中的光譜通道數(shù)。

16、優(yōu)選的，步驟s2中尋找目標(biāo)細(xì)胞位置的方法是在水平成像面上移動(dòng)檢測(cè)樣本至聚焦光斑。

17、優(yōu)選的，樣本的拉曼光譜包括蓋玻片的拉曼光譜、細(xì)胞樣本的拉曼光譜和載玻片的拉曼光譜。

18、優(yōu)選的，歸一化定位系數(shù)如下式所示：

19、；

20、式中，c1表征拉曼測(cè)試蓋玻片與激發(fā)光斑的軸向距離，c2表征拉曼測(cè)試載玻片與激發(fā)光斑的距離。

21、優(yōu)選的，步驟s6中構(gòu)建判別模型的方法具體包括：選擇歸一化定位系數(shù)ci取值在0.4~0.6范圍的數(shù)據(jù)建立訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫(kù)；基于主成分分析對(duì)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，選取主成分?jǐn)?shù)量，使選擇的主成分對(duì)應(yīng)方差占總量的80%以上，再基于線性判別分析方法建立判別模型。

22、優(yōu)選的，步驟s6中訓(xùn)練判別模型采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法；判別方法具體包括：采集待測(cè)細(xì)胞樣本的拉曼光譜，選擇選擇歸一化定位系數(shù)ci取值在0.4~0.6范圍的數(shù)據(jù)作為測(cè)試集數(shù)據(jù)，將測(cè)試集數(shù)據(jù)帶入訓(xùn)練好的判別模型，得到判別結(jié)果。

23、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明能夠取得如下有益效果：

24、本發(fā)明提出了一種新型的細(xì)胞拉曼顯微檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位判斷方法，通過(guò)在顯微拉曼測(cè)試中，在細(xì)胞樣本制作過(guò)程中引入兩種不同材質(zhì)玻片，測(cè)定玻片的標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜后，將細(xì)胞樣本置于兩個(gè)玻片中間，測(cè)試獲得樣本整體光譜后，通過(guò)最小二乘法等回歸算法計(jì)算兩玻片對(duì)整體測(cè)試?yán)庾V強(qiáng)度的貢獻(xiàn)量，據(jù)此創(chuàng)新性地給出了細(xì)胞激發(fā)光斑歸一化定位系數(shù)，據(jù)此可以在不進(jìn)行樣本染色、不標(biāo)記的情況下，避免對(duì)細(xì)胞拉曼測(cè)試產(chǎn)生干擾的情況，可以精確實(shí)現(xiàn)細(xì)胞拉曼光譜顯微檢測(cè)中，細(xì)胞拉曼軸向激發(fā)位置的客觀定位判斷、校準(zhǔn)。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞拉曼光譜檢測(cè)中，對(duì)于聚焦光斑在細(xì)胞軸向（垂直于顯微成像面）方向上激發(fā)位置的定位及判斷的客觀方法，擺脫人為經(jīng)驗(yàn)觀測(cè)引入的采樣誤差，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞拉曼軸向激發(fā)位置的歸一化，確保數(shù)據(jù)采集的準(zhǔn)確性，為后續(xù)的精準(zhǔn)分析打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

技術(shù)特征：

1.一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述步驟s4中的回歸算法為最小二乘法；細(xì)胞樣本的拉曼光譜的表達(dá)式如下：

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：蓋玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)a1或載玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)a2的取值最小為0。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述步驟s4中相關(guān)線性方程組表達(dá)式如下：

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述步驟s2中尋找目標(biāo)細(xì)胞位置的方法是在水平成像面上移動(dòng)檢測(cè)樣本至聚焦光斑。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述樣本的拉曼光譜包括蓋玻片的拉曼光譜、細(xì)胞樣本的拉曼光譜和載玻片的拉曼光譜。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述歸一化定位系數(shù)如下式所示：

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述步驟s6中構(gòu)建判別模型的方法具體包括：選擇歸一化定位系數(shù)ci取值在0.4~0.6范圍的數(shù)據(jù)建立訓(xùn)練集數(shù)據(jù)庫(kù)；基于主成分分析對(duì)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)進(jìn)行降維，選取主成分?jǐn)?shù)量，使選擇的主成分對(duì)應(yīng)方差占總量的80%以上，再基于線性判別分析方法建立判別模型。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法，其特征在于：所述步驟s6中訓(xùn)練判別模型采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法；判別方法具體包括：采集待測(cè)細(xì)胞樣本的拉曼光譜，選擇選擇歸一化定位系數(shù)ci取值在0.4~0.6范圍的數(shù)據(jù)作為測(cè)試集數(shù)據(jù)，將測(cè)試集數(shù)據(jù)帶入訓(xùn)練好的判別模型，得到判別結(jié)果。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞顯微拉曼檢測(cè)軸向精準(zhǔn)定位及判斷方法。包括：選擇拉曼光譜存在差異的玻片作為載玻片和蓋玻片；通過(guò)測(cè)試得到歸一化標(biāo)準(zhǔn)拉曼光譜；將待測(cè)細(xì)胞樣本固定于兩玻片中間，置于顯微物鏡之下，在普通白光照明下調(diào)節(jié)焦距，再切換為激光，在細(xì)胞樣本上形成激發(fā)拉曼信號(hào)的聚焦光斑，檢測(cè)此時(shí)樣本的拉曼光譜；構(gòu)造相關(guān)線性方程組，利用回歸算法求解出兩玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，計(jì)算得到細(xì)胞拉曼光譜；根據(jù)兩玻片拉曼光譜的強(qiáng)度系數(shù)，構(gòu)造光斑軸向的歸一化定位系數(shù)；構(gòu)建并訓(xùn)練判別模型；用訓(xùn)練好的判別模型對(duì)待測(cè)細(xì)胞樣本進(jìn)行判別。優(yōu)點(diǎn)在于：無(wú)需標(biāo)記、染色等，直接實(shí)現(xiàn)細(xì)胞拉曼軸向激發(fā)位置客觀定位判斷。

技術(shù)研發(fā)人員：遲明波,吳一輝
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/28