本發(fā)明屬于生物標(biāo)志物，具體涉及基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、脂質(zhì)不僅是細(xì)胞膜組成成分，同時(shí)作為細(xì)胞功能的重要執(zhí)行者參與調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程，如細(xì)胞增殖、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等，對(duì)人體健康和大腦功能起著重要作用。大腦中富含大量脂質(zhì)，脂質(zhì)平衡的破壞與阿爾茨海默病(alzheimer's?disease，ad)等神經(jīng)退行性疾病有關(guān)。

2、研究發(fā)現(xiàn)，ad患者的腦組織中脂質(zhì)代謝發(fā)生顯著變化，尤其是在與神經(jīng)元膜組成和功能相關(guān)的磷脂和膽固醇方面，如脂筏改變和脂質(zhì)過(guò)氧化可能通過(guò)影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性、信號(hào)傳導(dǎo)、能量代謝等途徑，參與ad的病理進(jìn)程。因此，解析脂質(zhì)與ad之間的聯(lián)系對(duì)于揭示疾病的代謝問(wèn)題至關(guān)重要。

3、脂質(zhì)結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜多樣性，通常由骨架結(jié)構(gòu)、脂肪酰基鏈和頭部集團(tuán)組成。因?yàn)樗鼈兊慕M合性質(zhì)，碳原子數(shù)量、不飽和程度、脂肪酸含量和頭部基團(tuán)的變化等均對(duì)脂質(zhì)的鑒定提出了挑戰(zhàn)。在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，研究者通常只針對(duì)一個(gè)前體離子及對(duì)應(yīng)骨架結(jié)構(gòu)的碎片離子進(jìn)行檢測(cè)，忽略了其結(jié)構(gòu)異質(zhì)性對(duì)于鑒定準(zhǔn)確性的影響。因此，建立準(zhǔn)確鑒定脂質(zhì)分子的方法對(duì)于充分探索、了解異質(zhì)性脂質(zhì)的功能具有重要意義。

4、近年來(lái)脂質(zhì)分析方法取得長(zhǎng)足進(jìn)步，特別是基于質(zhì)譜(mass?spectrometry，ms)的脂質(zhì)組學(xué)，可對(duì)生物樣本中的脂質(zhì)進(jìn)行高通量分析，不僅具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，而且還可以提供結(jié)構(gòu)信息。

5、如今，脂質(zhì)組學(xué)分析常用的技術(shù)是lc-esi-ms/ms，可區(qū)分同分異構(gòu)體的同時(shí)減少電離抑制，但其有限的電離和碎裂條件不能適用于所有脂類。“shotgun脂質(zhì)組學(xué)”則是另一種補(bǔ)充方法，在直接輸注樣品的過(guò)程中，可從恒定的溶液濃度中獲得感興趣的脂類分子對(duì)應(yīng)的離子信息，以揭示脂質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)和種類。此外，為了更精確地表征和定量樣品中的分子，須采用高分辨率/高質(zhì)量精度的平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)/多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple?reactionmonitoring，mrm)方法對(duì)脂質(zhì)進(jìn)行靶向定量分析。因而，利用lc-mrm/ms技術(shù)可系統(tǒng)解析ad中脂質(zhì)分子變化特征，有助于我們提高對(duì)ad病理機(jī)制的理解，同時(shí)支持基于血液生物標(biāo)志物的開發(fā)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的在于提供基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

3、基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，包括以下步驟：

4、步驟一，shotgun脂質(zhì)組學(xué)確定血漿脂質(zhì)表達(dá)譜：

5、用注射泵將脂質(zhì)提取物以8μl/分鐘的流速推入三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，分別在正、負(fù)電噴霧電離模式下，針對(duì)脂質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)進(jìn)行前體離子和中性丟失掃描，包括脂肪酸、甘油磷脂、甘油酯、鞘脂、甾醇；脂質(zhì)分子的確定是基于質(zhì)譜數(shù)據(jù)，在lipid?mspredict?tool輔助下手動(dòng)注釋；

6、步驟二，lc-mrm/ms進(jìn)行脂質(zhì)定量分析：

7、基于步驟一獲取的脂質(zhì)分子的m/z，骨架結(jié)構(gòu)和脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)的離子信息，建立lc-mrm/ms掃描方法，即設(shè)置脂質(zhì)分子名稱，前體離子m/z，兩個(gè)特征性碎片離子的m/z,去簇電壓(ce)，射入電壓(ep)，碰撞能(ce)，碰撞室射出電位(cxp)，掃描時(shí)間(time)，利用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀qtrap?6500系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，通過(guò)監(jiān)測(cè)分別對(duì)應(yīng)骨架結(jié)構(gòu)和脂肪酸鏈結(jié)構(gòu)的兩個(gè)特征性離子在相同保留時(shí)間內(nèi)共流出以確定同一個(gè)脂質(zhì)分子；

8、步驟三，數(shù)據(jù)分析

9、在skyline中導(dǎo)入原始數(shù)據(jù)，根據(jù)內(nèi)標(biāo)或已知標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行峰校準(zhǔn)，然后導(dǎo)出各個(gè)碎片離子的峰面積，每個(gè)脂質(zhì)分子的含量可用兩個(gè)碎片離子的峰面積總和表示；為進(jìn)一步排除個(gè)體差異或進(jìn)樣體積的影響，數(shù)據(jù)經(jīng)峰面積歸一化后，獲得各個(gè)脂質(zhì)分子的相對(duì)含量，明確兩組間脂質(zhì)變化特征，將各個(gè)脂質(zhì)分子相對(duì)含量的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、預(yù)處理，并利用metaboanalyst?5.0進(jìn)行多變量統(tǒng)計(jì)分析；

10、在此外，偏最小二乘法判別分析(pls-da)算法對(duì)特征進(jìn)行分類和篩選以獲取生物標(biāo)志物；

11、步驟四，機(jī)器學(xué)習(xí)

12、使用支持向量機(jī)(svm)對(duì)脂質(zhì)分子進(jìn)行分類和重要性排序，從中挑選出最具判別力的脂質(zhì)分子作為生物標(biāo)志物。

13、優(yōu)選的，所述步驟一中使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)(qtrap?4000，sciex)進(jìn)行脂質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)掃描。

14、優(yōu)選的，所述步驟二中使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜qtrap?6500系統(tǒng)進(jìn)行mrm掃描。

15、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

16、1、利用同時(shí)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)分子的前體離子對(duì)應(yīng)的兩個(gè)特征性碎片離子在相同的保留時(shí)間共流出的lc-mrm/ms方法，可增加脂質(zhì)分子鑒定的準(zhǔn)確性。

17、2、基于質(zhì)譜定量數(shù)據(jù)和多變量統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法，可以對(duì)健康人群和阿爾茨海默癥患者進(jìn)行準(zhǔn)確分類，提高分類準(zhǔn)確率。

技術(shù)特征：

1.基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟一中使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜系統(tǒng)(qtrap?4000，sciex)進(jìn)行脂質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)掃描。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟二中使用三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜qtrap?6500系統(tǒng)根據(jù)兩個(gè)特征性離子信息進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(mrm)。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了基于質(zhì)譜的阿爾茨海默癥早期診斷的血漿脂質(zhì)檢測(cè)方法，制備方法包括以下步驟，shotgun脂質(zhì)組學(xué)確定血漿脂質(zhì)表達(dá)譜、LC?MRM/MS進(jìn)行脂質(zhì)定量分析、數(shù)據(jù)分析和機(jī)器學(xué)習(xí)，本發(fā)明通過(guò)利用同時(shí)監(jiān)測(cè)脂質(zhì)分子的前體離子對(duì)應(yīng)的兩個(gè)特征性碎片離子在相同的保留時(shí)間共流出的LC?MRM/MS方法，增加脂質(zhì)分子鑒定的準(zhǔn)確性，結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)算法在挖掘潛在的生物標(biāo)志物方面具有較高的應(yīng)用前景，可輔助臨床醫(yī)生進(jìn)行早期診治。

技術(shù)研發(fā)人員：高霞,楊倩,鄭龍龍,盧建軍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2025/1/9