本發(fā)明涉及植物提取領(lǐng)域(ipc分類(lèi)號(hào)：c12p)，尤其涉及一種白及多糖基于nf-κb信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、自然界中天然多糖分布廣泛，越來(lái)越多研究表明多糖具備一定的免疫調(diào)節(jié)活性，且天然多糖所具備的其他藥理作用，例如：抗癌抗腫瘤、降低血糖、抗細(xì)胞衰老等，這些藥理作用在一定程度上直接或間接的通過(guò)免疫調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，植物多糖可以通過(guò)刺激生命體體內(nèi)的巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞單獨(dú)或共同增殖，釋放細(xì)胞炎癥因子等物質(zhì)激活有機(jī)體細(xì)胞免疫，從而直接或間接的促進(jìn)體液免疫運(yùn)作及生命體組織、器官等的免疫應(yīng)答，因此，多糖在增強(qiáng)身體對(duì)病原體天然免疫機(jī)制的同時(shí)，也在一定程度上治療了機(jī)體的免疫受損。但是，多糖在免疫機(jī)制中所發(fā)揮的實(shí)效性作用，目前還未明晰。

2、現(xiàn)有技術(shù)對(duì)免疫機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，活化后的巨噬細(xì)胞主要是通過(guò)增加分泌il-6(白介素6)、il-β(白介素β)、tnf-α(腫瘤壞死因子α)、ifn-γ(干擾素γ)等細(xì)胞因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)或促進(jìn)免疫作用的產(chǎn)生。其中il-β、il-6等細(xì)胞因子主要參與調(diào)控機(jī)體內(nèi)病變細(xì)胞如：腫瘤細(xì)胞等周邊巨噬細(xì)胞的招募直接誘發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，或者通過(guò)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)或誘發(fā)機(jī)體其它先天免疫和獲得性免疫的同時(shí)發(fā)生，因此是宿主防御反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)者；tnf-α具有腫瘤壞死活性的重要宿主調(diào)節(jié)分子的同時(shí)，還能在原基礎(chǔ)上進(jìn)一步活化機(jī)體內(nèi)的多種免疫細(xì)胞，從而強(qiáng)化機(jī)體的免疫應(yīng)答；ifn是一類(lèi)可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的糖蛋白，在機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫中起到重要的調(diào)節(jié)作用，而多糖組分可促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌ifn-γ，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。因此，對(duì)目標(biāo)多糖組分干預(yù)后的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，能夠驗(yàn)證多糖組分的免疫活性。

3、中國(guó)專(zhuān)利cn102641284b公開(kāi)了一種螺旋藻多糖的應(yīng)用，中國(guó)專(zhuān)利cn105535011a公開(kāi)了一種香菇菌多糖的應(yīng)用，但是不同來(lái)源的多糖仍存在著免疫調(diào)節(jié)活性的差異，現(xiàn)有技術(shù)對(duì)不同來(lái)源的多糖仍處于挖掘探索階段。白及作為一類(lèi)具有活血止血、生肌促愈的中藥材，其成分中的多糖含量可高達(dá)50％以上，但是目前針對(duì)于白及多糖的免疫調(diào)節(jié)活性探究極少。中國(guó)專(zhuān)利cn110684812a-一種具有免疫活性的白及多糖及其制備方法與應(yīng)用，該方法采用酶解法提取白及多糖，并驗(yàn)證了白及多糖對(duì)dpph·，abts+·等有一定的清除作用。該方法還研究了不同濃度白及多糖對(duì)raw264.7細(xì)胞存活率的影響，以及白及多糖誘導(dǎo)raw264.7細(xì)胞活化釋放免疫因子tnf-α的分泌量。但是該技術(shù)對(duì)于白及多糖的免疫活性驗(yàn)證還非常有限，驗(yàn)證數(shù)據(jù)較為薄弱，不能夠全面、客觀地反映出白及多糖的免疫機(jī)制，準(zhǔn)確衡量白及多糖的免疫調(diào)節(jié)活性。

4、基于此，探究白及中性多糖基于nf-κb信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)活性，為后續(xù)動(dòng)物體內(nèi)活性研究實(shí)驗(yàn)等提供前期研究基礎(chǔ)和參考依據(jù)，成為本領(lǐng)域亟需解決的技術(shù)問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明選取分離純化后的白及(拉丁學(xué)名bletilla?striata)多糖組分，一方面基于巨噬細(xì)胞raw264.7研究其免疫調(diào)節(jié)活性。具體采用酶聯(lián)免疫試劑盒的方式對(duì)目標(biāo)多糖組分干預(yù)后的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，從而驗(yàn)證多糖組分的免疫活性。另一方面采用wb(蛋白免疫印跡法)對(duì)白及多糖是否產(chǎn)生基于nf-κb的蛋白通過(guò)產(chǎn)生免疫抗炎作用進(jìn)行驗(yàn)證，為后續(xù)白及-多糖的免疫抗炎作用研究奠定基礎(chǔ)。

2、本發(fā)明提供了一種白及多糖基于nf-κb信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用，所述白及多糖應(yīng)用于nf-κb信號(hào)通路中p65、p-p65、p-iκbα、cox-2、inos蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)。

3、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖通過(guò)水提醇沉法對(duì)白及藥材處理獲得。水提醇沉法結(jié)合了水提法和醇沉法兩種技術(shù)，本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)該方法既可以簡(jiǎn)便高效地收集到白及多糖，且獲得的白及多糖具有很好的抗炎效果，能夠基于nf-κb信號(hào)通路進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。

4、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增值率為90％以上。

5、進(jìn)一步優(yōu)選的，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增值率為110％以上。

6、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞中tnf-α細(xì)胞因子的分泌量為700pg/ml以上。

7、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞中inf-γ細(xì)胞因子的分泌量為220pg/ml以上。

8、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞中il-6細(xì)胞因子的分泌量為100pg/ml以上。

9、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖對(duì)raw264.7巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)后，raw264.7巨噬細(xì)胞中il-β細(xì)胞因子的分泌量為65pg/ml以上。

10、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號(hào)通路后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)nf-κb途徑中p-p65的蛋白表達(dá)為灰度值1.2以上。

11、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號(hào)通路后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)nf-κb途徑中p-iκbα的蛋白表達(dá)為灰度值1.5以上。

12、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號(hào)通路后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)nf-κb途徑中inos的蛋白表達(dá)為灰度值1.5以上。

13、在一些優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述白及多糖作用于nf-κb信號(hào)通路后，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)nf-κb途徑中cox-2的蛋白表達(dá)為灰度值1.0以上。

14、nf-κb是免疫相關(guān)通路中最了解的成分之一，其作為一種轉(zhuǎn)錄因子，由兩個(gè)nf-κb單體與抑制性iκb蛋白結(jié)合組成。巨噬細(xì)胞的刺激導(dǎo)致一系列蛋白水解和磷酸化過(guò)程，通過(guò)這些過(guò)程，nf-κb/iκb復(fù)合物發(fā)生了分解，nf-κb遷移到細(xì)胞核中，激活促炎介質(zhì)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，iκb是調(diào)控炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵分子，本實(shí)驗(yàn)采用western?blot等方法，觀察bsp及bsp-2對(duì)nf-κb通路中p65、p-p65、iκb(比如p-iκb、p-iκbα)、cox-2、inos等蛋白的影響，從分子層面探討白及多糖抗炎效應(yīng)的作用機(jī)制。

15、本發(fā)明的研究意義還在于，為一些后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供研究基礎(chǔ)，例如可使用更多方法多維度對(duì)白及多糖發(fā)揮免疫抗炎作用進(jìn)行研究，且加入必要的體內(nèi)研究實(shí)驗(yàn)，還可有針對(duì)性的對(duì)某一炎癥如：氣道炎等進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，以期進(jìn)一步驗(yàn)證其免疫抗炎作用。同時(shí)白及多糖組分的體外實(shí)驗(yàn)研究中，還可以進(jìn)一步補(bǔ)充使用人源相關(guān)免疫細(xì)胞，為后續(xù)有關(guān)藥物的研究開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)，人源的細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于藥物下一步可能的臨床效用具有不可替代的重要意義。

16、有益效果：

17、本發(fā)明提供一種一種白及多糖基于nf-κb信號(hào)通路的免疫調(diào)節(jié)應(yīng)用，具有以下優(yōu)點(diǎn)：

18、(1)白及作為廣泛使用的傳統(tǒng)中藥材，無(wú)論是臨床應(yīng)用還是科研探索前沿都具有較高熱度。本發(fā)明意外發(fā)現(xiàn)白及多糖發(fā)揮免疫抗炎的作用可能是通過(guò)幫助機(jī)體及時(shí)發(fā)揮或者恢復(fù)免疫機(jī)能而實(shí)現(xiàn)，為后續(xù)白及多糖的有關(guān)研究奠定了可靠的理論基礎(chǔ)。

19、(2)本發(fā)明開(kāi)展了關(guān)于白及多糖組分bsp-2的體外研究，主要是通過(guò)使用如lps(脂多糖)等物質(zhì)誘導(dǎo)至巨噬細(xì)胞raw264.7活化，之后再與使用了一定濃度多糖組分的實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行對(duì)比，從而驗(yàn)證了白及多糖bsp-2在有機(jī)體內(nèi)能發(fā)揮抗炎免疫作用，同時(shí)推測(cè)其發(fā)揮免疫抗炎作用可能是基于nf-κb信號(hào)通路，

20、(3)研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，受到lps刺激后的巨噬細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子顯著增加，其分泌量與空白組比較具有顯著差異(p<0.05)，而使用bsp和bsp-2的梯度濃度藥物(500、62.52、15.525μg·ml-1)的實(shí)驗(yàn)組均能在一定程度減少細(xì)胞炎癥因子的分泌量，且藥物濃度實(shí)驗(yàn)組炎癥因子分泌量與lps組相比具有顯著差異(p<0.05)，體現(xiàn)了白及多糖對(duì)免疫細(xì)胞的作用顯著。

21、(4)本發(fā)明通過(guò)蛋白免疫印跡法初步驗(yàn)證白及多糖組分bsp-2可通過(guò)對(duì)nf-κb信號(hào)通路途徑中inos、cox-2、p65、p-p65、iκbα和p-iκbα通路蛋白的影響，調(diào)節(jié)促炎因子和抑炎因子的平衡，從而發(fā)揮免疫抗炎作用。

22、(5)中藥多糖通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫能力從而具有一定的抗癌活性，其中巨噬細(xì)胞是與中藥多糖發(fā)揮抗腫瘤作用聯(lián)系最為緊密的免疫細(xì)胞之一，本發(fā)明確定了白及多糖具備增強(qiáng)機(jī)體抗炎免疫作用，在此基礎(chǔ)上能夠進(jìn)一步探究白及多糖組分對(duì)某些癌癥腫瘤是否具備一定抑制作用，從而進(jìn)一步擴(kuò)大白及多糖的藥理作用研究。(6)本發(fā)明探究了白及藥材中多糖組分的生物活性和在免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制，為白及中活性成分的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了可行性思路。