本發(fā)明涉及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性檢測(cè)，特別涉及一種液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1、液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是定位在液泡膜上將糖轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)出液泡的一類蛋白，也是植物上重要的一類糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。在植物中，液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與到植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)過程，對(duì)維持細(xì)胞滲透平衡具有重要作用。在部分高糖積累的植物器官中，液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白更是發(fā)揮了重要的糖分積累的功能。目前植物上發(fā)現(xiàn)的液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要有3種類型，一種是將蔗糖或己糖逆運(yùn)進(jìn)液泡的h+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白亞族tmt/tst；一種是將液泡內(nèi)的蔗糖運(yùn)出液泡的h+同向運(yùn)輸?shù)鞍譻ut4，還有一種是不依賴能力和質(zhì)子梯度的糖運(yùn)輸?shù)鞍譻weet。

2、分析液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性對(duì)于分析該蛋白的功能具有重要的意義。目前，用于分析液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性功能的方法主要有酵母異源表達(dá)系統(tǒng)、爪蟾卵母異源表達(dá)系統(tǒng)以及電壓鉗及膜片鉗等技術(shù)。這些技術(shù)都分別存在不同的局限性，比如利用酵母突變體和爪蟾卵母細(xì)胞都是屬于非植物異源表達(dá)系統(tǒng)，在某些情況下蛋白異源表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生錯(cuò)誤靶向，且異源系統(tǒng)中缺乏蛋白質(zhì)修飾也可能會(huì)干擾糖攝取分析；電壓鉗和膜片鉗則對(duì)儀器設(shè)備及操作員的技術(shù)要求特別高，而且只有部分轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在糖轉(zhuǎn)運(yùn)過程存在質(zhì)子梯度，即使存在質(zhì)子梯度，電流相對(duì)微弱，常常難以檢測(cè)到有效電流，這就導(dǎo)致這些技術(shù)難以普及和應(yīng)用。因此，急需開發(fā)更加便捷、易操作且能保留植物細(xì)胞內(nèi)源特定修飾的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)的新方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述問題，本發(fā)明提供了一種液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)的新方法，利用內(nèi)源性液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性較低的膨大期甜瓜果實(shí)原生質(zhì)體作為待檢測(cè)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的內(nèi)源或植物異源表達(dá)宿主，通過糖熒光類似物飼喂過表達(dá)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的甜瓜果實(shí)原生質(zhì)體的方法檢測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性。該方法操作簡(jiǎn)便，效率高，不依賴同位素且具有內(nèi)外源的液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性都可檢測(cè)的特點(diǎn)，還保持了植物液泡本身的特性，能夠降低液泡內(nèi)背景信號(hào)的干擾，提高植物液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析的準(zhǔn)確性和靈敏性。

2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、本發(fā)明提供了一種液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，包括以下步驟：

4、s1、構(gòu)建表達(dá)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化膨大期甜瓜果實(shí)，獲得轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)；

5、s2、培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)至所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，之后酶解所述轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)的果肉細(xì)胞，獲得果肉原生質(zhì)體；

6、s3、將所述原生質(zhì)體加入到糖熒光類似物培養(yǎng)液中孵育一段時(shí)間，孵育結(jié)束后將所述原生質(zhì)體清洗干凈，之后檢測(cè)所述原生質(zhì)體中液泡內(nèi)的熒光信號(hào)，根據(jù)熒光強(qiáng)度評(píng)估所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

7、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為tst/tmt、sut或sweet家族蛋白，所述甜瓜為甜寶、綠寶石或羊角蜜。

8、更進(jìn)一步地，步驟s1中，所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為tst2，所述甜瓜為綠寶石。

9、進(jìn)一步地，步驟s1中，構(gòu)建液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的植物表達(dá)載體包括以下步驟：

10、s11、獲取所述液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因片段；

11、s12、利用限制性內(nèi)切酶線性化植物表達(dá)載體，將所述基因片段通過重組法構(gòu)建到所述植物表達(dá)載體中，獲得表達(dá)所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的植物表達(dá)載體；其中，所述植物表達(dá)載體為ph7lic5.0或pbwa(v)hs。

12、進(jìn)一步地，所述植物表達(dá)載體還帶有熒光蛋白編碼基因，所述熒光蛋白為gfp、mcherry或rfp。

13、進(jìn)一步地，步驟s1中，所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化入膨大期甜瓜果實(shí)內(nèi)。

14、進(jìn)一步地，步驟s2中，酶解所述轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)的果肉細(xì)胞包括以下步驟：將所述轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)切片，置于酶解液中，抽真空，搖床培養(yǎng)2-3h，獲得所述原生質(zhì)體；其中，所述酶解液配方為：0.6m甘露醇、10mm?mes、10mm?cacl2、0.1％牛血清白蛋白、1.5％纖維素酶、0.4％離析酶和0.005％中性紅。

15、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述糖熒光類似物為esculin(七葉皂苷，蔗糖熒光類似物)、nbd-f(4-氟-7-硝基-2,1,3-苯并氧雜惡二唑，4-fluoro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole，果糖熒光類似物)或2-nbdg(2-(n-7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-氨基)-2-脫氧-d-葡萄糖，2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]-d-glucose，葡萄糖熒光類似物)。

16、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述糖熒光類似物培養(yǎng)液包括0.6m甘露醇、10mm?mes、10mmcacl2和1mm糖熒光類似物，將所述原生質(zhì)體加入到所述糖熒光類似物培養(yǎng)液中孵育12-24h。

17、進(jìn)一步地，步驟s3中，熒光強(qiáng)度通過imagej軟件統(tǒng)計(jì)所述原生質(zhì)體的液泡中心處的熒光信號(hào)獲得。

18、進(jìn)一步地，步驟s3中，根據(jù)熒光強(qiáng)度評(píng)估所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性包括以下步驟：通過t檢驗(yàn)比較液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)組和對(duì)照組之間的熒光強(qiáng)度差異評(píng)估所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。

19、本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及積極效果為：

20、1、本發(fā)明利用內(nèi)源性液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性較低的膨大期甜瓜果實(shí)原生質(zhì)體作為待檢測(cè)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異源表達(dá)宿主，外源基因易在甜瓜果實(shí)中實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)高效表達(dá)，之后通過糖熒光類似物飼喂過表達(dá)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的甜瓜果實(shí)原生質(zhì)體的方法檢測(cè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性，具有操作簡(jiǎn)便，效率高，不依賴同位素且具有內(nèi)外源的液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性都可檢測(cè)的特點(diǎn)，而且，原生質(zhì)體的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性較低，能夠降低液泡內(nèi)背景信號(hào)的干擾，提高液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析的準(zhǔn)確性和靈敏性。此外，可通過在一個(gè)原生質(zhì)體中共轉(zhuǎn)兩個(gè)不同的基因，探究互作蛋白對(duì)糖轉(zhuǎn)運(yùn)活性的影響。

21、2、本發(fā)明的甜瓜果實(shí)原生質(zhì)體來源豐富，原生質(zhì)體飼喂技術(shù)操作方法簡(jiǎn)單，有利于進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，保證結(jié)果真實(shí)可靠性，并降低實(shí)驗(yàn)成本。

技術(shù)特征：

1.一種液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s1中，所述液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為tst/tmt、sut或sweet家族蛋白，所述甜瓜為甜寶、綠寶石或羊角蜜。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s1中，構(gòu)建液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的植物表達(dá)載體包括以下步驟：

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，所述植物表達(dá)載體還帶有熒光蛋白編碼基因，所述熒光蛋白為gfp、mcherry或rfp。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s1中，所述植物表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化入膨大期甜瓜果實(shí)內(nèi)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s2中，酶解所述轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)的果肉細(xì)胞包括以下步驟：

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s3中，所述糖熒光類似物為esculin、nbd-f或2-nbdg。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s3中，所述糖熒光類似物培養(yǎng)液包括0.6m甘露醇、10mm?mes、10mm?cacl2和1mm糖熒光類似物，將所述原生質(zhì)體加入到所述糖熒光類似物培養(yǎng)液中孵育12-24h。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法，其特征在于，步驟s3中，熒光強(qiáng)度通過imagej軟件統(tǒng)計(jì)所述原生質(zhì)體的液泡中心處的熒光信號(hào)獲得；

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明屬于糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性檢測(cè)方法。所述方法包括：構(gòu)建表達(dá)液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化膨大期甜瓜果實(shí)，獲得轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)；培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因甜瓜果實(shí)至液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)，之后酶解獲得原生質(zhì)體；將原生質(zhì)體加入到糖熒光類似物培養(yǎng)液中，孵育一段時(shí)間，之后檢測(cè)原生質(zhì)體中液泡的熒光信號(hào)，根據(jù)熒光強(qiáng)度評(píng)估液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)便，效率高，不依賴同位素且具有內(nèi)外源的液泡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性都可檢測(cè)的特點(diǎn)，還保持了植物液泡本身的特性，能夠降低液泡內(nèi)背景信號(hào)的干擾，提高植物液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)活性分析的準(zhǔn)確性和靈敏性。

技術(shù)研發(fā)人員：成金桃,周奕軒,黃瑞杰,別之龍
受保護(hù)的技術(shù)使用者：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/23