本發(fā)明屬于生物檢測領域，具體涉及了一種crispr-免疫聯(lián)合小分子檢測探針制備方法及其相關檢測方法和用途。

背景技術：

1、近年來，crispr系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)研究為核酸靶標的檢測提供全新的方法，而利用crispr系統(tǒng)對非核酸靶標（如小分子物質(zhì)）的工作十分有限。然而，在醫(yī)藥、環(huán)境和食品安全等領域?qū)π》肿訕擞浳锘蛭廴疚锏臋z測十分重視，如β-激動劑就是一類具有代表性的小分子污染物，常被非法用于動物養(yǎng)殖，能引起人體急性中毒或慢性蓄積性中毒，并給生物鏈和環(huán)境帶來長期的難以估計的影響。盡管危害嚴重，但現(xiàn)階段針對如β?-激動劑這類禁用的小分子污染物檢測方法中，儀器分析法已非常成熟，但是該方法弊端在于樣品預處理復雜，依賴昂貴的儀器和專業(yè)的技術人員；生物傳感器法不穩(wěn)定的特性造成了方法難以用于實際應用；免疫分析法優(yōu)勢在于操作簡便，耗時短，同時擁有良好的穩(wěn)定性，但該方法的缺點主要在于靈敏度更多依賴抗體本身的性質(zhì)，對于法律規(guī)定禁止檢出的β-激動劑來說檢測性能不夠。結合免疫分析法的特異性、可調(diào)控性以及crispr/cas系統(tǒng)的超高靈敏度和信號穩(wěn)定性，建立crispr-免疫聯(lián)合檢測體系，可以彌補當下免疫分析方法的不足。

2、目前，crispr檢測小分子主要利用適配體、抗體和細菌變構轉(zhuǎn)錄因子作為橋梁實現(xiàn)核酸信號的轉(zhuǎn)化，例如中國專利cn111812066a給出的一種借助于細菌變構轉(zhuǎn)錄因子與crispr/cas12a系統(tǒng)，通過crispr/cas12a的順式切割和反式切割活性將小分子信號轉(zhuǎn)化為光信號的的檢測方法。相比于抗體，篩選合適的適配體和細菌變構轉(zhuǎn)錄因子作為非核酸靶標識別原件更困難。澳大利亞專利wo2023019290a1提出一種crispr/cas12a驅(qū)動的免疫傳感器用于檢測水樣中的整個隱孢子蟲卵囊細胞。然而，在crispr-免疫聯(lián)合體系檢測小分子這方面的研究仍然缺乏。因此亟需一種能將crispr/cas系統(tǒng)與免疫分析系統(tǒng)融合，操作簡單、特異性強、靈敏度高且具有現(xiàn)場快速檢測的潛力的檢測小分子新方法。

技術實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供了一種免疫反應、rpa等溫擴增體系和crispr/cas12a體系三者有機結合的dsdna-抗體探針、組合物、小分子檢測試劑盒及其相關檢測方法和用途。以dsdna-抗體探針作為橋梁將免疫體系和crispr體系結合，一方面利用dsdna-抗體探針的抗體部分對小分子進行特異性識別，另一方面利用dsdna-抗體探針的核酸部分，借助rpa擴增體系和crispr/cas12a體系達到信號放大和信號輸出的目的。

2、為此，本發(fā)明采取以下技術方案：

3、第一方面，本發(fā)明提供了一種dsdna-抗體探針的合成方式，所述的dsdna-抗體探針由dsdna和單克隆抗體通過一種化學生物偶聯(lián)方法共價偶聯(lián)而成。

4、其中，所述dsdna為任意的，可進行rpa等溫擴增和crispr系統(tǒng)識別激活的dsdna。

5、其中，所述dsdna?為5’端帶-nh2修飾的dsdna；

6、其中，所述單克隆抗體包括但不僅限于沙丁胺醇單克隆抗體，也可替換成其它小分子的單克隆抗體。

7、其中，所述化學生物偶聯(lián)方法使用到雙功能交聯(lián)劑4-（n-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（sulfo-smcc）和n-琥珀酰亞胺基-s-乙酰硫基乙酸酯（sata）分別對dsdna和抗體產(chǎn)生化學反應，形成共價鍵，見實施例1。

8、第二方面，本
技術實現(xiàn)要素：
還包括所述dsdna-抗體探針的構建方法：將dsdna與單克隆抗體通過共價連接得到dsdna-抗體探針。所述dsdna-抗體探針通過dsdna與抗體摩爾濃度比1：1反應制備。

9、第三方面，本發(fā)明提供一種用于檢測小分子的試劑盒，所述試劑盒包含識別試劑、擴增試劑和信號輸出試劑。

10、其中，所述識別試劑包含dsdna-抗體探針，所述dsdna包含與抗體進所述行化學生物偶聯(lián)的-nh2修飾部分、rpa等溫擴增體系的靶標序列、crispr/cas12a系統(tǒng)的識別位點pam以及與crrna部分互補的序列。

11、其中，所述擴增試劑包含所述rpa等溫擴增系統(tǒng)，包含靶標dsdna正向，反向引物、mgoac、dntps、靶標dsdna、2×reaction?buffer、10×basic?e-mix、20×core?reactionmix和/或水；

12、其中2×reaction?buffer、10×basic?e-mix、20×core?reaction?mix均為twistdx公司的dna恒溫快速擴增試劑盒中的試劑。rpa正向、反向引物針對靶標dsdna進行設計。

13、其中，所述信號輸出試劑包含所述crispr/cas12a系統(tǒng)，包含cas12a酶、crrna、單鏈dna探針（ssdna-reporter）、nebuffer、rnase?inhibitor和/或水。

14、其中，ssdna-reporter兩端分別綴合fam報告基團和bhq淬滅基團。

15、第四方面，本發(fā)明內(nèi)容提供了一種crispr-免疫聯(lián)合小分子檢測方法，包括如下步驟：

16、s1.?將包被原包埋在酶標板中，加入dsdna-抗體探針，通過抗體與包被原特異性識別結合，洗板過后，dsdna-抗體探針固定在酶標板上；

17、s2.?將rpa試劑加入上述體系中，針對dsdna進行指數(shù)擴增；

18、s3.?將crispr試劑加入到上述反應體系中，crispr中的crrna特異性識別靶標dsdna上的pam位點進行順式切割，同時激活crispr蛋白的旁切割活性，任意切割熒光報告分子產(chǎn)生熒光信號，使用quantstudio3real-time?pcr或波長470nm的便攜式紫外藍光切膠儀進行檢測，實現(xiàn)對分析物的定量或定性分析。

19、具體地，步驟s1中包被原濃度為2.56?pg/ml，dsdna-抗體探針稀釋比例為1：16000，見實施例2。

20、具體地，步驟s2中rpa擴增反應的反應條件為10?μl反應體積，其中包含0.5μm正向引物和反向引物、2.0?mm?dntps、22.4?mm?mgoac，整個擴增過程在37°c加熱25?min下完成，見系列實驗4。

21、具體地，步驟s3中crispr體系的反應條件為10?μl反應體積，其中包含cas12a蛋白125?nm，crrna為50?nm，ssdna-reporter為1000?nm，反應時間10?min，見系列實驗2。

22、本發(fā)明有以下有益效果：

23、本發(fā)明是將酶聯(lián)免疫檢測、rpa擴增技術與crispr檢測技術相結合，通過合成dsdna-抗體探針作為橋梁將免疫系統(tǒng)和crispr/cas12a系統(tǒng)結合，利用抗體對小分子的特異性識別能力，借助rpa核酸擴增進行信號放大及crispr/cas12a的切割活性產(chǎn)生熒光信號，實現(xiàn)免疫信號向熒光信號的轉(zhuǎn)變，建立了crispr-免疫聯(lián)合小分子檢測體系。所述檢測方法特異性強、靈敏度高。

24、本發(fā)明引入了一種dsdna-抗體探針，它是通過將dsdna和單克隆抗體共價偶聯(lián)而成。一方面利用dsdna-抗體探針的抗體部分對小分子進行特異性識別，另一方面利用dsdna-抗體探針的核酸部分，借助rpa擴增體系和crispr/cas12a體系達到信號放大和信號輸出的目的。該探針可同時發(fā)揮免疫功能和核酸信號傳導功能，使操作更簡單。

25、本發(fā)明所述的crispr-免疫聯(lián)合小分子檢測方法，只需根據(jù)不同的小分子選擇相應的抗體，合成dsdna-抗體探針，其他組分無需更換，即可實現(xiàn)對不同小分子的檢測，其通用性強。