本發(fā)明涉及檢測試樣中的靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法和試劑，特別涉及能夠高靈敏度且廉價地檢測靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法和試劑。

背景技術(shù)：

1、一直以來，已知通過檢測與疾病相關(guān)的特定抗原或抗體作為生物標(biāo)記物、從而發(fā)現(xiàn)疾病或者定性或定量地分析治療效果等的免疫測定方法。近年來，為了更有效地檢測生物標(biāo)記物，對于檢測微量生物標(biāo)記物的高靈敏度檢測的需求日益提高。作為免疫測定方法之一的酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked?immuno?sorbent?assay)(本說明書中也稱為“elisa法”。)是用特異性抗體、與靶抗體結(jié)合的抗原、互補(bǔ)核酸來捕捉試樣溶液所包含的靶抗原、抗體或核酸并利用酶反應(yīng)進(jìn)行檢測的方法，由于成本等優(yōu)勢已經(jīng)得到廣泛普及。

2、elisa法是能夠進(jìn)行靶標(biāo)物質(zhì)的定量檢測的測定方法，目前所普及的elisa法幾乎都是在96孔微孔板上進(jìn)行操作，工序數(shù)多且需要煩雜的操作。另外，由于經(jīng)歷多個反應(yīng)工序，因此需要大量的勞動和時間才能得到測定結(jié)果。因此，正在尋求縮短操作時間、反應(yīng)時間。進(jìn)而還尋求進(jìn)一步的高靈敏度檢測。

3、為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度檢測，想到了提高酶與底物的反應(yīng)性。因此，提出了例如使添加了報告物質(zhì)的免疫復(fù)合體(標(biāo)記化合物)從固相游離、使其在自由液體介質(zhì)中反應(yīng)的技術(shù)(專利文獻(xiàn)1)。該專利文獻(xiàn)1中，以將生物素類或官能團(tuán)化偶氮色素以及親和素類引入免疫復(fù)合體的方式設(shè)計了免疫復(fù)合體的構(gòu)成要素。例如，作為標(biāo)記抗體，準(zhǔn)備了通過鏈霉親和素-生物素的結(jié)合而結(jié)合有報告基團(tuán)的抗體。當(dāng)在固相上形成免疫復(fù)合體時，報告基團(tuán)通過鏈霉親和素-生物素的結(jié)合而被導(dǎo)入免疫復(fù)合體中。之后如果加入過量鏈霉親和素，則復(fù)合體中的鏈霉親和素被所添加的鏈霉親和素置換出來，免疫復(fù)合體中的報告分子則游離出來。因此，該技術(shù)中，可以在自由液體介質(zhì)中檢測報告分子，并與待檢體中的被檢體濃度相關(guān)聯(lián)。

4、另外，為了高靈敏度地檢測免疫復(fù)合體，利用微細(xì)加工技術(shù)開發(fā)了在μm級別的微容器中進(jìn)行反應(yīng)的微反應(yīng)器。使用反應(yīng)場為微空間的微反應(yīng)器有望提高反應(yīng)速度。使用微小的流路、反應(yīng)室在微反應(yīng)器上實(shí)現(xiàn)提取、分離等實(shí)驗操作的方式也被稱為lab?on?achip。另外，提出了在圓盤狀的盤上形成微反應(yīng)器且利用旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力分配試樣液、分離生物學(xué)材料的技術(shù)(專利文獻(xiàn)2)。另外，提出了如下技術(shù)：在圓盤狀的盤上形成多個腔室、流路、儲槽等，通過使盤旋轉(zhuǎn)來執(zhí)行試劑的送液、排液，在微反應(yīng)器中實(shí)施在孔中通過手動方式進(jìn)行的免疫測定步驟(專利文獻(xiàn)3)。

5、在該微反應(yīng)器中的免疫測定中，為了檢測低濃度的靶標(biāo)物質(zhì)，提出了使用標(biāo)記珠的方法(專利文獻(xiàn)4)。例如，專利文獻(xiàn)4公開了一種圓盤狀的盤，其表面設(shè)置有填充抗體修飾標(biāo)記珠的珠填充部、檢測區(qū)域。并且公開了：用標(biāo)記珠上的抗體捕捉注入盤中的試樣液中的抗原，并且標(biāo)記珠上結(jié)合有抗原的標(biāo)記珠復(fù)合體通過盤的旋轉(zhuǎn)而被送入檢測區(qū)域，被檢測區(qū)域中固定的抗體捕捉；利用光盤裝置的光學(xué)讀取手段對處于固定于檢測區(qū)域的狀態(tài)的標(biāo)記珠復(fù)合體的數(shù)量進(jìn)行計數(shù)，從而檢測試樣中的靶標(biāo)物質(zhì)。

6、另一方面，在使用盤的分析方法中，提出了如下方法：在盤上設(shè)置的反應(yīng)場內(nèi)將抗原負(fù)載珠、熒光igg抗體標(biāo)記試劑和樣品混合，與靶標(biāo)物質(zhì)結(jié)合而形成復(fù)合體后使盤旋轉(zhuǎn)，通過所產(chǎn)生的離心力將珠從反應(yīng)場導(dǎo)入填充有密度梯度介質(zhì)的分離腔室，通過照射電磁照射束來檢測復(fù)合體。分離腔室中填充有密度梯度介質(zhì)，所導(dǎo)入的珠由于離心力而移動至密度梯度介質(zhì)中的等密度點(diǎn)，并靜止在此處。并且，通過檢測來自等密度點(diǎn)的熒光，可以檢測靶標(biāo)免疫復(fù)合體。根據(jù)該分析方法，能夠?qū)⑽唇Y(jié)合于與珠的等密度點(diǎn)不同的免疫復(fù)合體的多余熒光標(biāo)記等與靶標(biāo)免疫復(fù)合體分離，不進(jìn)行清洗操作也能夠檢測免疫復(fù)合體(專利文獻(xiàn)5)。

7、現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

8、專利文獻(xiàn)

9、專利文獻(xiàn)1：日本特表平6-505802號公報

10、專利文獻(xiàn)2：日本特開2008-185423號公報

11、專利文獻(xiàn)3：日本特表2002-503331號公報

12、專利文獻(xiàn)4：日本特開2012-255772號公報

13、專利文獻(xiàn)5：日本特表2006-505766號公報

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、發(fā)明要解決的問題

2、但是，專利文獻(xiàn)1記載的技術(shù)中，僅公開了使作為標(biāo)記物的報告分子游離到自由液體介質(zhì)中、在該液體中與底物進(jìn)行反應(yīng)，對于實(shí)現(xiàn)可實(shí)現(xiàn)低濃度的靶標(biāo)物質(zhì)的檢測這樣的檢測靈敏度提高、反應(yīng)性提高而言并不充分。

3、專利文獻(xiàn)2中，對于以高靈敏度進(jìn)行免疫測定法這一點(diǎn)沒有任何公開。專利文獻(xiàn)3不過公開了將以往的elisa法的工序安裝在微反應(yīng)器中。另外，微反應(yīng)器一方面可通過減小反應(yīng)場而提高反應(yīng)速度、反應(yīng)性，另一方面存在由于反應(yīng)體積變小、從而信號強(qiáng)度變小的問題。因此，如果想要通過專利文獻(xiàn)2和3記載的技術(shù)來實(shí)施免疫復(fù)合體的高靈敏度測定，則需要高靈敏度的檢測器、像機(jī)，存在成本提高的問題。

4、專利文獻(xiàn)4公開了將檢測對象設(shè)為標(biāo)記珠、從而使用通用的光盤裝置實(shí)施免疫測定的技術(shù)。通常，微反應(yīng)器中粒狀物的輸送也是造成堵塞的原因，但是專利文獻(xiàn)4的技術(shù)中在檢測區(qū)域中固定抗體、捕捉流入該檢測區(qū)域的負(fù)載有抗原的標(biāo)記珠，因此有可能發(fā)生標(biāo)記珠的局部堆積，有時存在實(shí)際操作變得困難的問題。另外，存在如下問題：檢測區(qū)域中捕捉的標(biāo)記珠彼此接近時，會導(dǎo)致檢測錯誤。

5、而且，專利文獻(xiàn)4中記載的技術(shù)是一邊使標(biāo)記珠流下一邊使固定的抗體與標(biāo)記珠負(fù)載的抗原之間進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)的，因此檢測區(qū)域整體均成為該抗原抗體反應(yīng)的反應(yīng)場。反應(yīng)性會受抗原與抗體的接觸頻率的影響，因此整個檢測區(qū)域成為反應(yīng)場的該技術(shù)中抗原抗體反應(yīng)效率容易下降。另外，由于是在同一反應(yīng)場進(jìn)行標(biāo)記珠的捕捉和其檢測(即，抗原的檢測)，因此在反應(yīng)效率低時檢測靈敏度會下降。進(jìn)而，抗體的流下速度可能導(dǎo)致固定的抗體難以捕捉標(biāo)記珠，因此存在檢測靈敏度、檢測速度進(jìn)一步變差的問題。

6、另外，專利文獻(xiàn)5記載的技術(shù)是使負(fù)載有復(fù)合體的珠聚集(偏在)在密度梯度介質(zhì)中的等密度點(diǎn)并進(jìn)行檢測。因此，聚集量越少則信號檢測越復(fù)雜，難以以更高的靈敏度來檢測樣品中的靶標(biāo)物質(zhì)。

7、本發(fā)明是鑒于上述問題而做出的，目的之一在于，提供與以往的技術(shù)相比能夠以高靈敏度廉價地檢測試樣中的靶標(biāo)物質(zhì)的技術(shù)。

8、用于解決問題的方案

9、根據(jù)其一個方面，本發(fā)明提供靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法，其包括：

10、通過使靶標(biāo)物質(zhì)夾入結(jié)合于標(biāo)記物的第1捕捉物質(zhì)與固定于固相的第2捕捉物質(zhì)之間而形成復(fù)合體，使包含標(biāo)記物的部分從形成的上述復(fù)合體分離后，

11、通過離心力使分離后的上述包含標(biāo)記物的部分在填充于管狀通道內(nèi)的液體中移動，

12、通過上述包含標(biāo)記物的部分將照射到上述管狀通道內(nèi)的光散射而產(chǎn)生的散射光來檢測上述包含標(biāo)記物的部分。

13、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，

14、在使上述包含標(biāo)記物的部分從上述復(fù)合體分離前，在上述復(fù)合體向上述管狀通道的流入受到抑制的狀態(tài)下實(shí)施對上述復(fù)合體進(jìn)行清洗的清洗處理。

15、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，實(shí)施上述清洗處理時，使用于清洗的清洗液充滿上述管狀通道。

16、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，使上述清洗處理中使用的清洗液貯存于比上述管狀通道靠下游側(cè)處。

17、根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式，通過將上述復(fù)合體保持在規(guī)定的腔室中，從而在上述復(fù)合體向上述管狀通道的流入受到抑制的狀態(tài)下實(shí)施上述清洗處理。

18、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法中，

19、在以能夠旋轉(zhuǎn)的方式形成的裝置中，從上述裝置的旋轉(zhuǎn)中心側(cè)向外側(cè)依次配置貯存上述清洗液的第1貯存室、上述腔室和貯存從上述腔室流出的液體的第2貯存室，上述第1貯存室與上述腔室利用能自由開關(guān)的流路而連通，上述腔室與上述第2貯存室利用上述管狀通道而連通，

20、本發(fā)明的方法包括：通過使上述裝置旋轉(zhuǎn)，將上述清洗液從上述第1貯存室送入上述腔室后，經(jīng)由上述管狀通道向上述第2貯存室排出而實(shí)施上述清洗處理。

21、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述第1貯存室與上述腔室利用能開放的流路而連通。

22、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述清洗處理進(jìn)行至上述第2貯存室和上述管狀通道被上述清洗液充滿為止。

23、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，本發(fā)明的方法中，

24、在上述裝置的比上述腔室靠旋轉(zhuǎn)中心側(cè)處配置第3貯存室，所述第3貯存室貯存含有用于使上述包含標(biāo)記物的部分從上述復(fù)合體分離的試劑的液體，上述第3貯存室與上述腔室利用能自由開關(guān)的流路而連通，

25、本發(fā)明的方法包括：通過使上述裝置旋轉(zhuǎn)，在上述清洗處理后向上述腔室送入包含上述試劑的液體而使上述包含標(biāo)記物的部分分離后，使分離后的上述包含標(biāo)記物的部分在上述管狀通道內(nèi)移動。

26、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述第3貯存室與上述腔室利用能開放的流路而連通。

27、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，檢測從上述管狀通道在規(guī)定時間內(nèi)斷斷續(xù)續(xù)地產(chǎn)生的散射光。

28、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述標(biāo)記物為比重大于充滿了上述管狀通道的液體的比重的物質(zhì)。

29、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述標(biāo)記物是以選自由金屬、陶瓷、玻璃和樹脂組成的組中的1種為主要構(gòu)成成分的微粒。

30、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述標(biāo)記物為金屬膠體顆粒。

31、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述固相為選自由玻璃顆粒、陶瓷顆粒、磁性顆粒和樹脂顆粒組成的組中的至少1種粒狀體。

32、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述固相為形成上述復(fù)合體時使用的容器內(nèi)側(cè)的結(jié)構(gòu)體。

33、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述包含標(biāo)記物的部分從上述復(fù)合體的分離是通過選自由加熱處理、ph調(diào)節(jié)處理、變性處理、氧化處理、還原處理、酶處理和競爭反應(yīng)處理組成的組中的至少1種處理來進(jìn)行的。

34、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述第1捕捉物質(zhì)為選自由與靶標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體、抗體片段、經(jīng)改造的抗體、抗原、適體和核酸組成的組中的至少1種。

35、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述第2捕捉物質(zhì)為選自由與靶標(biāo)物質(zhì)特異性結(jié)合的抗體、抗體片段、經(jīng)改造的抗體、抗原、適體和核酸組成的組中的至少1種。

36、根據(jù)本發(fā)明的其它方面，提供試劑，其為上述本發(fā)明的靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法中使用的試劑，其具有使上述包含標(biāo)記物的部分從上述復(fù)合體分離的作用。

37、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述本發(fā)明的試劑包含選自由ph調(diào)節(jié)劑、變性劑、還原劑、氧化劑、酶和競爭劑組成的組中的至少1種。

38、根據(jù)本發(fā)明的其它的優(yōu)選實(shí)施方式，上述本發(fā)明的試劑包含ph調(diào)節(jié)劑。

39、發(fā)明的效果

40、根據(jù)本發(fā)明的靶標(biāo)物質(zhì)的檢測方法，通過離心力使從上述復(fù)合體分離后的上述包含標(biāo)記物的部分(本說明書中也稱為“含有標(biāo)記物的碎片”)在填充于管狀通道內(nèi)的液體中移動，通過含有標(biāo)記物的碎片將照射到管狀通道內(nèi)的光反射、散射而產(chǎn)生的散射光來檢測含有標(biāo)記物的碎片。通常，檢測對象中的信號產(chǎn)生源(產(chǎn)生光學(xué)信號的物質(zhì)、標(biāo)記物)越小則以吸光度變化為信號檢測檢測對象時越需要復(fù)雜的技術(shù)。但是，本發(fā)明的方法以光學(xué)信號形式獲得散射光，因此能夠充分地檢測上述含有標(biāo)記物的碎片之類的微小檢測對象。

41、在此，使用散射光來檢測檢測對象時，檢測對象以外的物質(zhì)也會產(chǎn)生散射光，因此往往會產(chǎn)生不能特異性檢測檢測對象的問題。但是，本發(fā)明的方法中，液體中的含有標(biāo)記物的碎片通過離心力的作用而以固有的移動速度進(jìn)行移動，因此能夠特異性地檢測檢測對象即含有標(biāo)記物的碎片。進(jìn)而，本發(fā)明的方法中，含有標(biāo)記物的碎片在填充于管狀通道內(nèi)的液體中通過離心力的作用而移動，因此以比隨著液體流動而移送時慢的速度進(jìn)行移動。因此可以說，根據(jù)本發(fā)明的方法，在含有標(biāo)記物的碎片通過離心力而在管狀通道內(nèi)移動的過程中，能夠容易地獲得來自含有標(biāo)記物的碎片的散射光。

42、進(jìn)而，根據(jù)本發(fā)明的方法，例如在使用珠作為固相時，即使在1個珠上負(fù)載多個靶標(biāo)物質(zhì)，由于不是以珠單位來計作1而能夠逐次檢測(計數(shù))從珠分離的含有標(biāo)記物的碎片的數(shù)量，因此發(fā)揮能夠高靈敏度地檢測靶標(biāo)物質(zhì)的效果。

43、根據(jù)本發(fā)明的試劑，能夠良好地分離復(fù)合體中的包含標(biāo)記物的部分、即含有標(biāo)記物的碎片，因此能夠提供適合于檢測靶標(biāo)物質(zhì)的試劑。