本發(fā)明涉及外泌體檢測，特別是涉及一種檢測胰腺癌外泌體的檢測探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、胰腺癌在世界范圍內(nèi)仍然是最致命的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計，胰腺癌患者病死率高達80％以上，發(fā)病總?cè)藬?shù)呈逐年遞增態(tài)勢。由于相對隱蔽、缺乏特異性生物標志物、5年生存率低的特點，胰腺癌早期診斷和轉(zhuǎn)移監(jiān)測困難，臨床診治極具挑戰(zhàn)性，其帶來的社會成本也相當(dāng)高昂。傳統(tǒng)生物標志物癌胚抗原(carcinoembryonic?antigen,cea)和糖類抗原19-9(carbohydrate?antigen?19-9,ca19-9)雖然一定程度上提高了胰腺癌的診斷靈敏度，但ca19-9在良性胰腺疾病中同樣高表達，癌胚抗原更是在胃腸道腫瘤中普遍表達增高，在胰腺癌診斷中特異性較低。常規(guī)檢測難以體現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性、微環(huán)境、活性等生物學(xué)屬性，對胰腺癌早期診斷價值有限。因此，建立新的方法來提高胰腺癌診斷和預(yù)后評估的特異性和敏感性，是提高胰腺癌早期診斷率，延長胰腺癌患者生存時間、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。

2、已有研究通過蛋白組學(xué)分析驗證了外泌體可以識別特定的癌癥類型并區(qū)分腫瘤來源，其中磷脂酰肌醇蛋白聚糖1(glypican-1,gpc-1)是胰腺癌外泌體上一種膜錨定蛋白。胰腺癌患者血清外泌體中g(shù)pc-1為高表達，其診斷特異度和敏感度均可高達100％，并可早期分辨正常人、胰腺癌及慢性胰腺炎患者。在胰腺癌的生存、預(yù)后及診療中存在明顯價值。外泌體表面蛋白gpc-1在胰腺癌中作用已經(jīng)受到了廣泛的關(guān)注，因此gpc-1可以作為檢測靶標，用于胰腺癌早期診療及預(yù)后評估具有重要的臨床意義和研究價值。

3、表面增強拉曼散射(surface-enhanced?raman?scattering,sers)光譜具有超靈敏、快速和無損等優(yōu)點，能成倍增強放大固有的分子指紋信息，以實現(xiàn)對生物分子、病原體、癌細胞等進行靈敏且特異的檢測，已形成一個高速發(fā)展的生物分析領(lǐng)域。然而，sers在實踐應(yīng)用方面仍面臨檢測結(jié)果可靠性、重復(fù)性不佳等問題。sers基底對sers增強有決定性作用，基底材料的選擇、制備的方法以及成品的大小、形狀、尺寸、均勻度等都會影響sers的增強效果。因此，sers基底的合理設(shè)計和制備是影響檢測結(jié)果可靠性和重復(fù)性的關(guān)鍵。為實現(xiàn)高選擇、特異性強、穩(wěn)定性好的sers檢測，研究制備穩(wěn)定高效的sers基底材料，并實現(xiàn)其功能化是多年來sers領(lǐng)域的重要研究方向。

4、一般物質(zhì)分子的拉曼信號橫截面積較小，難以檢測，但部分物質(zhì)分子的拉曼信號橫截面積相對較大，能更易被檢測到，因此多被選為信號標記分子即拉曼報告分子，提高檢測的靈敏度。拉曼報告分子根據(jù)其特征峰的分布情況主要分為靜默區(qū)拉曼報告分子和非靜默區(qū)拉曼報告分子。目前常見的拉曼報告分子有cy3、rox、r6g、4-mba等。目前關(guān)于檢測物一般根據(jù)抗原抗體反應(yīng)、核酸適配體等方法進行捕獲，結(jié)合穩(wěn)定的拉曼報告分子，提高檢測的準確性。進一步提高sers傳感器的選擇性，來制造新型生物傳感器?；跇撕灥膕ers檢測具有高度靈敏度和可重復(fù)性；因此，可以用不同的拉曼報告分子實現(xiàn)多物種檢測。與無標簽方法相比，基于標簽的策略具有高靈敏度和可重復(fù)性。但是，能否根據(jù)sers傳感器特異性檢測胰腺癌外泌體，以及如何構(gòu)建sers傳感器可高效靈敏、特異性地檢測，現(xiàn)有技術(shù)相關(guān)研究報道少之甚少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種檢測胰腺癌外泌體的檢測探針及其應(yīng)用，以解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，該檢測探針可實現(xiàn)胰腺癌外泌體的快速、靈敏檢測，對臨床胰腺癌的診斷研究有重要意義。

2、為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下方案：

3、本發(fā)明提供一種檢測外泌體的檢測探針，所述檢測探針以銀納米粒子為骨架，負載拉曼報告分子，所述拉曼報告分子結(jié)合外泌體表面蛋白抗體。

4、進一步地，所述拉曼報告分子包含4-巰基苯甲酸；所述外泌體表面蛋白抗體包含gpc-1抗體。

5、進一步地，所述4-巰基苯甲酸通過巰基端負載在銀納米粒子上，通過羧基端與gpc-1抗體的氨基共價結(jié)合。

6、本發(fā)明還提供一種上述檢測探針的制備方法，包括以下步驟：

7、檸檬酸鈉、硝酸銀和氯化鈉溶液混合攪拌，制成預(yù)混懸浮液；在水和抗壞血酸攪拌加熱制成的混合液中加入所述預(yù)混懸浮液，繼續(xù)攪拌加熱獲得銀納米膠體溶液；

8、拉曼報告分子與所述銀納米膠體溶液混合孵育，向混合孵育后的混合溶液中加入活化劑活化，獲得銀納米拉曼報告分子偶聯(lián)混合物；

9、在銀納米拉曼報告分子偶聯(lián)混合物中加入外泌體表面蛋白抗體混合反應(yīng)，得到所述檢測探針。

10、進一步地，所述檸檬酸鈉、硝酸銀和氯化鈉溶液的體積比為20：5：4；其中，檸檬酸鈉溶液和硝酸銀溶液的濃度均為1wt％，氯化鈉溶液的濃度為20mm。

11、進一步地，所述超純水和所述抗壞血酸的體積比為(400-500)：1；其中，所述抗壞血酸的濃度為0.1m。

12、進一步地，所述拉曼報告分子與所述銀納米膠體溶液的混合體積比為1：10；所述活化劑為2-(n-嗎啡啉)乙磺酸溶解1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺配制的混合溶液。

13、進一步地，所述混合溶液和所述活化劑的加入量為1：1，所述活化條件為37℃孵育30min。

14、本發(fā)明還提供一種上述檢測探針在制備檢測胰腺癌外泌體產(chǎn)品中的應(yīng)用。

15、本發(fā)明公開了以下技術(shù)效果：

16、本發(fā)明制備了檢測胰腺癌外泌體的檢測探針，該檢測探針以檸檬酸鈉和硝酸銀為原料，利用還原法合成銀納米膠體溶液，通過活化拉曼報告分子4-mba的巰基與銀納米材料形成穩(wěn)定共價ag-s鍵，完成納米材料的拉曼報告分子結(jié)合，再將活化的拉曼報告分子4-mba羧基與gpc-1氨基共價結(jié)合，制備出一種由銀納米材料偶聯(lián)4-mba報告分子，以gpc-1為靶標的胰腺癌外泌體的快速、靈敏的檢測探針。該檢測探針對外泌體的檢測在20分鐘內(nèi)完成，無需預(yù)處理，檢測過程方便快捷，適合臨床樣本的即時檢測。并且檢測下限低至1個顆粒/μl，可實現(xiàn)胰腺癌外泌體的快速、靈敏檢測。

17、綜合上述，本發(fā)明對外泌體的檢測在速度與效率上均明顯優(yōu)于常規(guī)檢測方法，且操作過程簡便。檢測探針中4-mba報告分子與銀納米形成的膠體溶液結(jié)合，保障了基底拉曼信號增強作用，并通過拉曼報告分子實現(xiàn)了拉曼信號的較穩(wěn)定的檢測，同時使用的表面蛋白gpc-1對胰腺癌外泌體有較高的特異性，結(jié)合拉曼報告分子明顯提高了檢測的靈敏度?？梢?，該檢測探針對臨床胰腺癌的診斷研究有重要意義。

技術(shù)特征：

1.一種檢測胰腺癌外泌體的檢測探針，其特征在于，所述檢測探針以銀納米粒子為骨架，負載拉曼報告分子，所述拉曼報告分子結(jié)合外泌體表面蛋白抗體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測探針，其特征在于，所述拉曼報告分子包含4-巰基苯甲酸；所述外泌體表面蛋白抗體包含gpc-1抗體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測探針，其特征在于，所述4-巰基苯甲酸通過巰基端負載在銀納米粒子上，通過羧基端與gpc-1抗體的氨基共價結(jié)合。

4.一種如權(quán)利要求1-3任一項所述檢測探針的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述檸檬酸鈉、硝酸銀和氯化鈉溶液的體積比為20：5：4；其中，檸檬酸鈉溶液和硝酸銀溶液的濃度均為1wt％，氯化鈉溶液的濃度為20mm。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述超純水和所述抗壞血酸的體積比為(400-500)：1；其中，所述抗壞血酸的濃度為0.1m。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述拉曼報告分子與所述銀納米膠體溶液的混合體積比為1：10；所述活化劑為2-(n-嗎啡啉)乙磺酸溶解1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺和n-羥基丁二酰亞胺配制的混合溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述混合溶液和所述活化劑的加入量體積比為1：1，所述活化條件為37℃孵育30min。

9.一種如權(quán)利要求1-3任一項所述檢測探針在制備檢測胰腺癌外泌體產(chǎn)品中的應(yīng)用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明公開了一種檢測胰腺癌外泌體的檢測探針及其應(yīng)用，屬于外泌體檢測技術(shù)領(lǐng)域，該檢測探針以銀納米粒子為骨架，負載拉曼報告分子，拉曼報告分子結(jié)合外泌體表面蛋白抗體；所述拉曼報告分子包含4?巰基苯甲酸；所述外泌體表面蛋白抗體包含GPC?1抗體。該檢測探針對外泌體的檢測在20分鐘內(nèi)完成，無需預(yù)處理，檢測過程方便快捷，適合臨床樣本的即時檢測。并且檢測下限低至1個顆粒/μL，可實現(xiàn)胰腺癌外泌體的快速、靈敏檢測，對臨床胰腺癌的診斷研究有重要意義。

技術(shù)研發(fā)人員：郭永燦,奚宇戈,王芬,趙梓君
受保護的技術(shù)使用者：西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26