本發(fā)明涉及生物傳感器，具體涉及一種檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥的紙基多色比色法。

背景技術(shù)：

1、乙酰膽堿酯酶(ache，ec?3.1.1.7)是一種絲氨酸水解酶，主要表達于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、神經(jīng)肌接頭以及紅細胞中。作為神經(jīng)系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶，乙酰膽堿酯酶的主要功能是通過快速水解神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿生成膽堿和乙酸，終止神經(jīng)沖動。此外，乙酰膽堿酯酶還參與腫瘤發(fā)生、淀粉樣纖維形成、細胞凋亡、炎癥調(diào)節(jié)、細胞生長及干細胞分化等生理過程。人體中乙酰膽堿酯酶的異常表達與阿爾茨海默病、帕金森病、亨廷頓病、多發(fā)性硬化及肌萎縮側(cè)索硬化等人類神經(jīng)退行性疾病相關(guān)。為治療這些疾病，一些乙酰膽堿酯酶抑制劑(如多奈哌齊、卡巴拉汀、加蘭他敏和石杉堿甲)被用作藥物，以使乙酰膽堿在大腦中的濃度增加。另一方面，其他乙酰膽堿酯酶抑制劑如有機磷農(nóng)藥(ops)可引起神經(jīng)中毒，并可能過度抑制乙酰膽堿酯酶活性而致命。因此，建立乙酰膽堿酯酶活性檢測的分析方法對膽堿能系統(tǒng)研究和監(jiān)測有機磷農(nóng)藥中毒和環(huán)境污染具有重要意義。

2、目前，許多分析方法被開發(fā)用于檢測乙酰膽堿酯酶活性以及有機磷農(nóng)藥，包括比色法、熒光法、電化學法和化學發(fā)光法等。與其他分析方法相比，比色法具有使用簡便、成本低廉、無需昂貴儀器及可用于現(xiàn)場檢測等優(yōu)點。例如，ellman's?method利用乙酰膽堿酯酶水解硫代乙酰膽堿的產(chǎn)物硫代膽堿與5，5-二硫基-2-硝基苯甲酸之間的顯色反應，實現(xiàn)可視化檢測乙酰膽堿酯酶活性以及有機磷農(nóng)藥。然而，該方法的準確度受假陽性效應及血液中血紅蛋白的干擾。而且，使用低摩爾吸光系數(shù)的有機試劑以及單色強度變化的檢測方法限制了其視覺檢測的靈敏性和準確性。由于人眼對多色變化比單色強度變化更敏感，開發(fā)靈敏的多色視覺檢測方法對檢測現(xiàn)場乙酰膽堿酯酶活性及有機磷農(nóng)藥具有重要意義。

3、納米金錐(aunbps)是同時具有橫向局域表面等離子體共振和縱向局域表面等離子體共振(llspr)的長條形的納米金粒子。不同長徑比的aunbps具有不同的llspr峰位(λllspr)，導致它們在可見光區(qū)呈現(xiàn)不同的顏色。同時，aunbps還具有顯著的局部電場增強效應、窄的llspr峰和高的折射率敏感度。這些卓越的性質(zhì)使aunbps成為構(gòu)建高靈敏多色比色傳感器的理想材料，目前已開發(fā)出多種基于aunbps蝕刻法或者生長法的多色比色傳感器。然而，該類傳感器大多受實際樣品中抗壞血酸(aa)和原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)等還原劑的干擾。此外，在這些傳感器中，aunbps的蝕刻/生長多在液體中進行，aunbps不可避免地被蝕刻液/生長液稀釋會影響視覺檢測的準確性和靈敏度。同時，aunbps在溶液中的不穩(wěn)定性導致需要繁瑣的aunbps濃縮液制備過程，而且仍會存在aunbps濃縮液和反應后的aunbps溶液(即檢測結(jié)果)不易保存的缺點。因此，開發(fā)操作簡單且可穩(wěn)定aunbps形態(tài)的固定化便攜裝置和建立靈敏高效的aunbps蝕刻方法對實現(xiàn)包括乙酰膽堿酯酶活性和機磷農(nóng)藥在內(nèi)的目標物的現(xiàn)場快速篩查和檢測是十分必要的。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明以新發(fā)現(xiàn)的au+歧化反應誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化反應為技術(shù)基礎(chǔ)，建立了一種檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥的紙基多色比色法。

2、本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥的紙基多色比色法，包括以下步驟：將納米金雙錐沉積在尼龍膜上，構(gòu)建紙基分析裝置；將含有au+的反應溶液加入紙基分析裝置中通過au+的歧化反應誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化，使得納米金雙錐產(chǎn)生顏色變化和縱向局域表面等離子體共振峰λllspr位置變化，從而實現(xiàn)可視化半定量檢測和紫外分光光度法定量檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥。

3、本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明在新發(fā)現(xiàn)的au+歧化反應誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化反應的基礎(chǔ)上，建立了乙酰膽堿酯酶活性調(diào)控au+歧化反應誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化反應的檢測體系。在該反應中，au+發(fā)生歧化反應生成au0和au3+，au0會沉積在納米金雙錐的側(cè)邊，而au3+特異性刻蝕納米金雙錐尖端。因此，au+發(fā)生歧化反應可改變aunbps的形貌，導致aunbps的顏色發(fā)生變化，同時也導致aunbps的λllspr發(fā)生變化。此外，通過抑制au+發(fā)生歧化反應，導致au+歧化誘導aunbps形貌變化反應受到抑制。綜上所述，所建立的檢測體系可通過au+的歧化反應誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化反應引起的納米金雙錐的顏色變化和λllspr變化來實現(xiàn)可視化半定量檢測和紫外分光光度法定量檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥。

4、而本發(fā)明方法中通過乙酰膽堿酯酶活性來調(diào)控au+歧化誘導納米金雙錐形貌變化的反應。乙酰膽堿酯酶可通過多種方式來影響au+的歧化反應，如通過乙酰膽堿酯酶的酶解反應得到的酶解產(chǎn)物來影響au+進行歧化反應。也可以通過乙酰膽堿酯酶參與的其他方式來影響au+進行歧化反應。也就是說只要能通過乙酰膽堿酯酶參與，并且對au+歧化誘導納米金雙錐形貌變化反應有影響，均在本發(fā)明所保護的范圍之內(nèi)。

5、在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進：

6、進一步地，當au+能夠通過發(fā)生歧化反應來誘導納米金雙錐的寬高比增加，反應后尼龍膜上納米金雙錐的λllspr開始逐漸藍移，且納米金雙錐的顏色從棕紅色向紅紫色變化，說明待測樣品中含有乙酰膽堿酯酶。

7、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：隨著乙酰膽堿酯酶活性的增加，能夠進行歧化反應的au+濃度增加，納米金雙錐的形態(tài)逐漸從雙錐體轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓體和不規(guī)則球體，使得納米金雙錐aunbps的顏色從棕紅色向紫紅色變化(棕紅色、棕色、草綠色、綠色、藍綠色、藍色、紫色和紅紫色)，并伴隨aunbps的λllspr藍移。通過該變化可判定待測樣品中是否含有乙酰膽堿酯酶。

8、進一步地，當反應液中預先加入定量的乙酰膽堿酯酶時，反應后尼龍膜上納米金雙錐的λllspr開始紅移，且納米金雙錐顏色由紅紫色向棕紅色變化，說明待測樣品中含有機磷農(nóng)藥。

9、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：當樣品中含有ops時，ops可以抑制反應液中ache的活性，導致能夠進行進行歧化反應的au+濃度減少，抑制了納米金雙錐的形貌變化。隨著ops濃度的增加，納米金雙經(jīng)反應后的形態(tài)逐漸從不規(guī)則球體向橢圓體和雙錐體轉(zhuǎn)變，使得納米金雙錐aunbps的顏色從紫紅色向棕紅色變化(紅紫色、紫色、藍色、藍綠色、綠色、草綠色、棕色和棕紅色)，并伴隨aunbps的λllspr藍移逐漸消失。通過該變化可判定待測樣品中是否含有有機磷農(nóng)藥。

10、綜上所述，ache活性的增加使得aunbps的顏色由棕紅色向紅紫色變化，且反應后尼龍膜上aunbps的λllspr逐漸藍移，而ops農(nóng)藥濃度的增加會導致aunbps的顏色從紅紫色逐步向棕紅色變化，且反應后尼龍膜上aunbps的λllspr逐漸紅移。通過該原理和結(jié)果可檢測待測樣品中是否含有乙酰膽堿酯酶或有機磷農(nóng)藥。

11、進一步地，當檢測乙酰膽堿酯酶活性時，含有au+的反應溶液包括：膽堿氧化酶、氯化乙酰膽堿、三(2-羧乙基)膦(tcep)、十六烷基三甲基溴化銨(ctab)、hcl和au+溶液；

12、檢測過程為：

13、將納米金雙錐沉積在尼龍膜上，構(gòu)建紙基分析裝置；

14、將待測樣品與含有膽堿氧化酶、氯化乙酰膽堿和tcep的緩沖溶液混合，得到酶解液；

15、將酶解液孵育，然后加入含有ctab和hcl的au+溶液，混勻，得到反應液；

16、將反應液進行孵育后，加入紙基分析裝置中，于35-50℃條件下反應2-10min，觀察納米金雙錐沉積膜的顏色和/或檢測納米金雙錐沉積膜在400-1000nm范圍內(nèi)的消光光譜，與標準紙基色卡對比和/或根據(jù)消光光譜將納米金雙錐λllspr的位移量代入標準工作曲線來測定乙酰膽堿酯酶活性。

17、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：向含有氯化乙酰膽堿、膽堿氧化酶和tcep的反應液中加入含有乙酰膽堿酯酶的樣品或標準品，氯化乙酰膽堿先經(jīng)乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶水解生成h2o2；h2o2可消耗tcep即h2o2將tcep氧化成tcepo；接著，向酶解液中加入含有ctab和hcl的au+溶液，tcepo無法螯合au+，從而導致au+能夠進行歧化反應；最后將上述混合液即反應液加入紙基分析裝置中，在含有aunbps的尼龍膜上完成au+誘導aunbps形貌轉(zhuǎn)化的過程。因此，ache活性的增加使得能夠進行歧化反應的au+濃度增加，反應后尼龍膜上aunbps的λllspr逐漸藍移，且aunbps的顏色由棕紅色向紅紫色變化。

18、進一步地，酶解液的孵育條件為：在35-40℃下孵育25-35min；反應液的孵育條件為：在45-55℃條件下孵育3-7min；含有au+的反應溶液中膽堿氧化酶的酶活為5-60u/l，氯化乙酰膽堿的濃度為50-400μm，tcep溶液的濃度為14-22μm，ctab的濃度為20-60mm，hcl濃度為20-60mm，au+的濃度為10-20μm。優(yōu)選酶解液的孵育條件為：在37℃下孵育30min；反應液的孵育條件為：在50℃條件下孵育5min；含有au+的反應溶液中膽堿氧化酶的酶活為40u/l，氯化乙酰膽堿的濃度為100μm，tcep溶液的濃度為20μm，ctab的濃度為40mm，hcl濃度為20mm，au+濃度為15μm。

19、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：通過優(yōu)化上述反應液中各成分的濃度，可提高反應的效率，提高其檢測靈敏度。

20、進一步地，當檢測有機磷農(nóng)藥時，含有au+的反應溶液包括：乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶、氯化乙酰膽堿、tcep、ctab、hcl和au+溶液；

21、檢測過程為：

22、將納米金雙錐沉積在尼龍膜上，構(gòu)建紙基分析裝置；

23、將待測樣品與含有乙酰膽堿酯酶的緩沖液混合，得到混合液；

24、將混合液孵育，然后加入含有膽堿氧化酶、氯化乙酰膽堿和tcep的緩沖溶液，混勻，得到酶解液；

25、將酶解液孵育，加入含有ctab和hcl的au+溶液，混勻，得到反應液；

26、將反應液進行孵育后，加入紙基分析裝置中，于35-50℃條件下反應2-10min，觀察納米金雙錐沉積膜的顏色和/或檢測納米金雙錐沉積膜在400-1000nm范圍內(nèi)的消光光譜，與標準紙基色卡對比和/或根據(jù)消光光譜將納米金雙錐λllspr的位移量代入標準工作曲線來測定有機磷農(nóng)藥濃度。

27、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：向含有氯化乙酰膽堿、乙酰膽堿酯酶、膽堿氧化酶和tcep的反應液中加入含有ops的樣品或標準品，ops可以抑制ache活性，從而保留底物氯化乙酰膽堿和tcep，tcep可以螯合au+，導致au+無法進行歧化反應，最后將上述混合液即反應液加入紙基分析裝置中，在含有aunbps的尼龍膜上完成au+誘導aunbps形貌轉(zhuǎn)化的過程。因此，ops濃度的增加抑制反應液中ache的活性，導致能夠進行進行歧化反應的au+濃度減少，使得尼龍膜上aunbps的顏色從紅紫色逐步向棕紅色變化，且反應后aunbps的λllspr逐漸紅移。

28、進一步地，在檢測有機磷農(nóng)藥時，混合液的孵育條件為：在35-40℃條件下孵育15-25min；酶解液的孵育條件為：在35-40℃下孵育25-35min；反應液的孵育條件為：在45-55℃條件下孵育3-7min；含有au+的反應溶液中乙酰膽堿酯酶的酶活為1-3u/l，膽堿氧化酶的酶活為5-60u/l，氯化乙酰膽堿的濃度為50-400μm，tcep溶液的濃度為14-22μm，ctab的濃度為20-60mm，hcl濃度為20-60mm，au+的濃度為10-20μm。優(yōu)選，混合液的孵育條件為：在37℃條件下孵育20min；酶解液的孵育條件為：在37℃下孵育30min；反應液的孵育條件為：在50℃條件下孵育5min；含有au+的反應體系中乙酰膽堿酯酶的酶活為2u/l，膽堿氧化酶的酶活為40u/l，氯化乙酰膽堿的濃度為100μm，tcep溶液的濃度為20μm，ctab的濃度為40mm，hcl濃度為20mm，au+濃度為15μm。

29、采用上述進一步技術(shù)方案的有益效果為：通過優(yōu)化上述反應液中各成分的濃度，可提高反應的效率，提高其檢測靈敏度。

30、進一步地，上述檢測乙酰膽堿酯酶的酶或檢測有機磷農(nóng)藥時，都是將反應液加入紙基分析裝置中，于50℃條件下反應6min。在該反應條件下，可以提高反應的效率和檢測靈敏度。

31、本發(fā)明具有以下有益效果：

32、1、本發(fā)明提供的通過紙基多色比色法來檢測乙酰膽堿酯酶活性和有機磷農(nóng)藥，其檢測原理涉及au+介導的aunbps形貌變化的反應、雙酶酶解策略和pad(紙基分析裝置)三個部分。

33、au+介導aunbps形貌變化的反應如圖3a所示。當au+在aunbps表面發(fā)生歧化反應，生成au0和au3+后，au0會沉積在aunbps的側(cè)面導致寬度增加，而au3+特異性刻蝕aunbps尖端，導致長度減小。由于au+歧化反應的凈結(jié)果可視為aunbps尖端部位的金原子向側(cè)面轉(zhuǎn)移，所以該反應被稱為au+介導aunbps形貌轉(zhuǎn)化。即隨著au+濃度的增加，納米金雙錐的形態(tài)逐漸從雙錐體轉(zhuǎn)變?yōu)闄E圓體和不規(guī)則球體，并伴隨著八種鮮艷的顏色變化，具體為顏色由棕紅色逐步變?yōu)樽厣?、草綠色、綠色、藍綠色、藍色、紫色和紅紫色。

34、雙酶酶解策略如圖3b所示：當樣品中含有乙酰膽堿酯酶時(路徑a)，氯化乙酰膽堿先經(jīng)乙酰膽堿酯酶和膽堿氧化酶水解生成h2o2，后者氧化tcep生成氧化產(chǎn)物tcepo。因為tcepo不能螯合au+，所以au+可以進行歧化反應。當乙酰膽堿酯酶和有機磷農(nóng)藥同時存在時(路徑b)，有機磷農(nóng)藥能有效抑制乙酰膽堿酯酶活性，從而保留了底物氯化乙酰膽堿和tcep。tcep可以螯合au+，導致au+無法進行歧化反應。

35、紙基分析裝置(pad)中含有沉積有納米金雙錐的尼龍膜(見圖3c)。當雙酶酶解策略中的反應液加入到紙基分析裝置中時，溶液中未被tcep螯合的au+會與尼龍膜上的納米金雙錐發(fā)生au+介導納米金雙錐形貌變化的反應。由于乙酰膽堿酯酶活性與自由的au+濃度成正比，有機磷農(nóng)藥濃度與自由的au+濃度成反比，所以乙酰膽堿酯酶活性的增加使得尼龍膜上納米金雙錐的顏色由棕紅色逐步變?yōu)樽厣?、草綠色、綠色、藍綠色、藍色、紫色和紅紫色，而有機磷農(nóng)藥濃度的增加會導致尼龍膜上納米金雙錐的顏色從紅紫色逐步變回紫色、藍紫色、藍色、藍綠色、綠色、草綠色和棕色。綜上所述，本研究開發(fā)了一種基于au+介導納米金雙錐形貌變化的pms(紙基多色傳感器)，可用于檢測乙酰膽堿酯酶活性或有機磷農(nóng)藥濃度。

36、2、與現(xiàn)有的檢測乙酰膽堿酯酶活性和有機磷農(nóng)藥的比色法相比，本發(fā)明所建立的比色法具有操作簡單、高通量、高靈敏度和多顏色信號等優(yōu)點。所設計的紙基分析裝置能夠同時檢測八個樣品。經(jīng)過沉積富集在尼龍膜上的納米金雙錐不會被反應液稀釋，保證了人眼檢測和儀器檢測的靈敏度。該方法根據(jù)乙酰膽堿酯酶活性和有機磷農(nóng)藥濃度的變化呈現(xiàn)出7-8種顏色變化，有助于裸眼半定量檢測。

37、與現(xiàn)有的基于刻蝕反應改變納米金雙錐形貌的比色方法相比，au+誘導納米金雙錐形貌轉(zhuǎn)化反應能夠有效避免實際樣品中還原劑的干擾。同時，納米金錐沉積膜的制備簡單，不同批次制備的納米金錐沉積膜的λllspr具有良好的重現(xiàn)性，且能夠長期存放，解決了液體中納米金雙錐濃縮液制備繁瑣、批次間重現(xiàn)性差以及無法長期保存的問題。此外，與液體中進行納米金雙錐形貌反應的比色方法相比，在所構(gòu)建的紙基分析裝置上進行該反應的檢測結(jié)果可穩(wěn)定保存，且呈現(xiàn)了優(yōu)異的反應重現(xiàn)性、高效的刻蝕效率和高檢測靈敏度。