本發(fā)明涉及抗體技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是將納米抗體應(yīng)用于檢測、診斷和治療。

背景技術(shù)：

1、抗體對抗原具有特異性結(jié)合的能力，能夠識別不同的蛋白，包括人血清白蛋白（human?serum?albumin，簡稱hsa），在生物醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，市場上不乏針對人血清白蛋白的抗體。在檢測方面，食品安全監(jiān)管需要及時檢測農(nóng)藥殘留、非法添加物等，各種基于免疫層析原理的快速檢測試紙條由于簡單、方便、快速、價廉，在食品監(jiān)管上發(fā)揮了巨大作用。在臨床診斷方面，免疫檢測是重要的檢測技術(shù)，具體的實例是目前廣泛應(yīng)用的新冠抗原檢測，利用針對新冠病毒的核蛋白（n?protein）的兩個抗體，采用雙抗夾心法，制備成免疫層析快速檢測試紙條，定性或定量地檢測新冠病毒的存在。在治療藥物方面，抗體已經(jīng)成為重要的藥物種類，不僅抗體本身可以作為藥物，而且抗體藥物還包括了由抗體衍生的抗體-毒素蛋白偶聯(lián)體（immunotoxin）、抗體-藥物偶聯(lián)體（antibody-drug?conjugate,?adc）、雙抗和多抗（bispecific?antibody,?multi-specific?antibody），等。

2、抗體分為多克隆抗體和單克隆抗體。多克隆抗體由免疫動物產(chǎn)生，為抗體的混合物，各批次間的抗體組成不同，效價有差異。單克隆抗體由單一基因產(chǎn)生，克服了多克隆抗體的批間次差異的問題。但單克隆抗體存在以下特點和不足：研發(fā)周期長，生產(chǎn)周期長，制備成本高，在機體內(nèi)不易被清除，穿透能力弱。

3、我們將常見的多克隆抗體和單克隆抗體統(tǒng)稱為常規(guī)抗體。納米抗體是常規(guī)抗體的簡化形式，早期在羊駝等動物的抗體中發(fā)現(xiàn)一種罕見的、只有重鏈的抗體，通過僅保留與抗原結(jié)合的單個結(jié)構(gòu)域，構(gòu)建成為大小在納米級別的納米抗體，又稱為單域抗體。納米抗體保留了常規(guī)抗體對抗原的高親和性和高特異性，還有以下優(yōu)點：單個結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性高；能夠在原核或真核細(xì)胞中高效表達(dá)；在原核細(xì)胞表達(dá)時，生長周期短、制備成本低；對人的免疫原性弱；分子量小，穿透能力強，甚至可以穿透血腦屏障。納米抗體在生物醫(yī)藥中得到了越來越廣泛的應(yīng)用，如獲批上市的雙特異性納米抗體ozoralizumab，利用抗人血清白蛋白的納米抗體對白蛋白的高親和性，來延長在體內(nèi)的存留時間，同時利用另一個融合在一起的抗腫瘤壞死因子tnfα的納米抗體，靶向藥物作用分子，用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。

4、人血清白蛋白在人血液中含量豐富，濃度約為42?g/l，占血液總蛋白的60%左右。在血液中，人血清白蛋白可以結(jié)合各種分子和離子（如脂肪酸、膽色素、氨基酸、類固醇激素、金屬離子、藥物分子等），同時維持血液正常的滲透壓。在臨床上，人血清白蛋白可用于治療休克與燒傷，用于補充因手術(shù)、意外事故等大出血所致的血液丟失，也可以作為血漿增容劑。人血清白蛋白是單鏈多肽，由585個氨基酸構(gòu)成，分子量為66?kda?；谌搜灏椎鞍椎拇罅啃枨?，人們對重組人血清白蛋白進(jìn)行了深入的研究，目前報道的重組表達(dá)系統(tǒng)有多種，包括大腸桿菌、畢赤酵母、水稻、煙草葉綠體、牛、豬、等。重組人血清白蛋白不僅需要產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低，在生理生化性質(zhì)、物理結(jié)構(gòu)、生物學(xué)功能、免疫原性等也要與血液來源的人血清白蛋白一致。高純度的重組人血清白蛋白產(chǎn)品有很大的市場需求。

5、腎功能是指腎臟排泄體內(nèi)代謝產(chǎn)物，維持機體鈉、鉀、鈣等電解質(zhì)的穩(wěn)定及酸堿平衡的功能。腎功能主要是通過腎小球的濾過、腎小管的重吸收實現(xiàn)的。腎小球為血液過濾器，是微小動脈壁構(gòu)成過濾膜，從內(nèi)到外有三層結(jié)構(gòu)：內(nèi)層為內(nèi)皮細(xì)胞層，為附著在腎小球基底膜內(nèi)的扁平細(xì)胞，上有無數(shù)孔徑大小不等的小孔，小孔有一層極薄的隔膜；中層為腎小球基膜，電鏡下從內(nèi)到外分為三層，即內(nèi)疏松層、致密層及外疏松層，為控制濾過分子大小的主要部分；外層為上皮細(xì)胞層，上皮細(xì)胞又稱足細(xì)胞，其不規(guī)則突起稱足突，其間有許多狹小間隙，血液經(jīng)濾膜過濾后，濾液入腎小球囊。在正常情況下，血液中人血清白蛋白和其他絕大部分蛋白質(zhì)不能濾過而保留于血液中，僅小分子物質(zhì)如尿素、葡萄糖、電解質(zhì)及某些小分子蛋白能濾過。所以，盡管白蛋白在血液中大量存在，但在正常尿液里只存在微量。臨床上，在尿液中能夠檢測到的白蛋白的量與腎功能直接相關(guān)，是慢性腎病診斷的一個重要指標(biāo)。24小時收集的尿液里，30-300?mg白蛋白稱為微量白蛋白尿；大于300?mg為大量白蛋白尿。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明是提供一個利用納米抗體，構(gòu)建用于腎功能檢測的免疫層析試紙條的技術(shù)方案。尿中的人血清白蛋白含量是腎功能的一個重要指標(biāo)。采取本發(fā)明所述技術(shù)方案，用納米抗體腎功能檢測試紙條，可以準(zhǔn)確、方便、快速地檢測尿液中的白蛋白，對腎功能的建全與否提供判斷依據(jù)。

2、本發(fā)明的首要目的是提供了一個構(gòu)建免疫層析試紙條的技術(shù)方案?？乖涂贵w的特異性結(jié)合是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵之處。所述技術(shù)方案中，抗原為人血清白蛋白，抗體為兩個抗人血清白蛋白的納米抗體，分別命名為納米抗體a和納米抗體b。免疫層析試紙條設(shè)置兩條檢測線，分別稱為t1線和t2線。t1線和t2線上分別固定白蛋白和納米抗體b。因此，檢測時，在t1線處，是競爭法免疫反應(yīng)，在t2線處，是雙抗夾心法免疫反應(yīng)。

3、納米抗體是本技術(shù)方案的特點和關(guān)鍵材料，有特殊的要求。首先，是結(jié)合部位。雙抗夾心法要求兩個納米抗體結(jié)合在抗原白蛋白的兩個相互獨立的不同表位；即它們各自都能夠與抗原結(jié)合，而且它們各自的結(jié)合不影響另一個的結(jié)合。其次，是特異性。所用納米抗體有對抗原白蛋白的特異性識別能力，能夠區(qū)分人血清白蛋白與（1）其他種屬的血清白蛋白等結(jié)構(gòu)相近的蛋白（如牛血清白蛋白），（2）尿液里可能出現(xiàn)的其他蛋白（如β2-微球蛋白）。本技術(shù)方案在t2線處采用雙抗夾心法，t2條帶的顯色是兩個納米抗體特異性識別抗原能力的疊加，更加增強了識別抗原的特異性。再次但更重要的，是親和性。對納米抗體a和b的要求是合適的親和性，不僅能夠有效捕獲抗原白蛋白、或捕獲白蛋白與納米抗體a的復(fù)合物，而且能夠在檢測的臨界值附近，同時在t1線和t2線處產(chǎn)生較大的色度變化。

4、作為優(yōu)選，納米抗體a和納米抗體b分別是我們先前得到的納米抗體4p和納米抗體2p（見專利申請：葉其壯等人，申請?zhí)朿n2023105650880）。

5、具體的，免疫層析試紙條的構(gòu)造包括樣本墊、結(jié)合墊、層析墊、吸收墊、底板，樣本墊、結(jié)合墊、層析墊、吸收墊，依次相互重疊2毫米粘貼在底板上。在結(jié)合墊上，吸附有彩色標(biāo)記的納米抗體a，彩色標(biāo)記是以便于肉眼觀察為目的，包括采用膠體金、膠體銀、膠體碳和各種顏色的彩色微球。優(yōu)選采用膠體金來彩色標(biāo)記納米抗體，標(biāo)記后的納米抗體a顯紅色（或酒紅色），帶有膠體金標(biāo)記的納米抗體的結(jié)合墊又稱金標(biāo)墊。在層析墊上，平行設(shè)置兩條檢測線，t1和t2線；所述t1線含有白蛋白，所述t2線含有納米抗體b。作為優(yōu)選，t1線處于靠近吸收墊的一端，t2線處于靠近結(jié)合墊的一端。當(dāng)納米抗體a的彩色標(biāo)記采用膠體金時，t1和t2線在檢測時顯紅色條帶。

6、按本技術(shù)方案構(gòu)建的免疫層析試紙條，在對結(jié)果的判讀時，是通過比較t1線和t2線色度的相對強弱，來確定樣本中白蛋白的量。在t1線處，固定有抗原白蛋白，彩色標(biāo)記的納米抗體a與白蛋白結(jié)合，t1線的色度隨樣本中白蛋白的量增加而減弱。在t2線處，固定有納米抗體b，彩色標(biāo)記的納米抗體a通過樣本中白蛋白，間接地與納米抗體b結(jié)合，t2線的色度隨樣本中白蛋白的量增加而增強。判讀的臨界值設(shè)定為20?mg/l,?優(yōu)選的檢測范圍設(shè)定為0-320?mg/l。樣本中，當(dāng)白蛋白的濃度在20?mg/l附近時，t1線和t2線的色度相近；當(dāng)白蛋白的濃度小于20?mg/l時，t1線的色度強于t2線的色度，為陰性結(jié)果；當(dāng)白蛋白的濃度在大于20?mg/l時，t1線的色度弱于t2線的色度，為陽性結(jié)果。由于在t2線處，顯色原理是雙抗夾心法，會有雙抗夾心法共有的鉤狀效應(yīng)，因此，檢測范圍設(shè)定在320?mg/l以下。本技術(shù)方案實際檢測在20?mg/l至320?mg/l的樣本白蛋白濃度區(qū)間內(nèi)，即使在接近320?mg/l的高濃度時，t2線的色度有所減弱，但可以清晰地顯示t1線的色度弱于t2線的色度，不影響檢測結(jié)果的確定。實際檢測在樣本白蛋白濃度高至1500?mg/l時，仍然能夠看到t2線，判讀為陽性結(jié)果。

7、按本技術(shù)方案構(gòu)建的免疫層析試紙條，俗稱“裸條”，即“條型”，制造簡單、生產(chǎn)成本低廉、使用也很方便，是一種優(yōu)選的產(chǎn)品包裝形式。另一種優(yōu)選的包裝形式是將試紙條裝入塑料卡殼內(nèi)，稱為免疫層析試紙卡，即“卡型”?？ㄐ团c條型是相同的腎功能檢測產(chǎn)品、不同的包裝方式；條型產(chǎn)品是裸露的試紙條，檢測時，將試紙條直接豎直插入尿液取樣；卡型產(chǎn)品則是在檢測時，將尿液加至試紙卡的加樣孔。取樣后，尿液與彩色標(biāo)記的納米抗體在試紙條上一同層析展開，在t1和t2處形成兩條不同色度的條帶。

8、按本技術(shù)方案構(gòu)建的免疫層析試紙條或免疫層析試紙卡，可以方便地應(yīng)用于通過收集隨機尿液樣本，檢測樣本里的白蛋白量，來實現(xiàn)腎功能的快速檢測。

9、本發(fā)明采用新型的生物材料納米抗體，構(gòu)建能夠準(zhǔn)確、方便、快速地檢測尿液里的白蛋白含量，判斷腎功能的健全與否。本發(fā)明的顯著益處包括：（1）穩(wěn)定性。穩(wěn)定性是納米抗體相對于常規(guī)抗體的一大優(yōu)點，本發(fā)明基于納米抗體構(gòu)建的免疫層析試紙條證實可以長時間耐受高溫，高穩(wěn)定性的益處是產(chǎn)品更便于儲存和運輸；（2）特異性。本發(fā)明采用識別抗原不同表位的兩個納米抗體，以此構(gòu)建的免疫層析試紙條已經(jīng)證實可以區(qū)分人與牛的血清白蛋白，顯示了很高的特異性，高特異性的益處是產(chǎn)品能夠有效區(qū)分白蛋白與其他蛋白，減少假陽性；（3）準(zhǔn)確性。本發(fā)明基于納米抗體構(gòu)建的免疫層析試紙條采用兩條顯色條帶色度變化相向而行的方式，提高了對結(jié)果判斷的準(zhǔn)確性，使得對結(jié)果的判定更容易。（4）經(jīng)濟性。市面上同類免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的是動物產(chǎn)生的單克隆和多克隆的常規(guī)抗體。本技術(shù)方案采用大腸桿菌產(chǎn)生的基因重組的納米抗體，不僅生產(chǎn)所需的時間降低，而且生產(chǎn)成本也大大降低。（5）一致性。納米抗體是基因工程產(chǎn)品，由同一基因表達(dá)產(chǎn)生，屬于單克隆，一致性良好，相對于多克隆抗體減少了批間次的差異。