一種基于流式熒光技術(shù)的肺炎支原體igm和igg的同步檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
1.本發(fā)明涉及一種檢測方法，更具體一點(diǎn)說，涉及一種基于流式熒光技術(shù)的肺炎支原體igm和igg的同步檢測方法，屬于生物技術(shù)檢測領(lǐng)域。


背景技術(shù)：

2.肺炎支原體(mp)是引起人類肺炎支原體肺炎的病原體。臨床研究指出，mp主要經(jīng)飛沫傳播，各年齡段人群均可感染，在兒童及青少年中感染率較高，其與間質(zhì)性肺炎、支氣管肺炎等的發(fā)生都有密切聯(lián)系。因此，早期診斷、早期治療尤為重要。近年來，肺炎支原體特異性抗體mp-igm和mp-igg的檢測新方法應(yīng)用于臨床，為臨床診斷肺炎支原體感染提供了一種血清學(xué)診斷手段。
3.由于健康人血清中一般不存在mp抗體，故血清中肺炎支原體抗體igm和igg檢測特異性高。應(yīng)用血清學(xué)方法檢測肺炎支原體的抗體igm和igg診斷呼吸道肺炎支原體感染，其抗體陽性結(jié)果能為肺炎支原體感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)學(xué)依據(jù)。mp-igm一般在感染后一周內(nèi)產(chǎn)生，第3-4周達(dá)到高峰后逐漸減弱，持續(xù)時間短；mp-igg在兩周之后逐漸升高，并維持較長時間的高水平。igm和igg聯(lián)合檢測、聯(lián)合分析、綜合了igm的早期診斷優(yōu)勢和igg特異性強(qiáng)、持續(xù)時間長的優(yōu)點(diǎn)，減少了漏診、誤診的概率，提高了診斷正確率。在同一樣品中同時完成兩種抗體的檢測，可降低試劑和人工的成本，且結(jié)果更可靠，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。
4.流式微球技術(shù)利用球形基質(zhì)作為載體,以流式細(xì)胞術(shù)作為檢測平臺,可以在較短時間內(nèi)對生物分子進(jìn)行大規(guī)模檢測。該系統(tǒng)主要基于流式熒光編碼微球，檢測通量大、靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)同步檢測多靶標(biāo)，具有較為廣闊的應(yīng)用空間。


技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

5.本發(fā)明提供了一種基于流式熒光技術(shù)的肺炎支原體igm和igg的檢測方法，利用不同熒光編碼磁性微球和同一種熒光蛋白實(shí)現(xiàn)在同一份樣品中同時檢測肺炎支原體igm和igg。
6.為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
7.一種基于流式熒光技術(shù)的肺炎支原體igm和igg的同步檢測方法，該制備方法為：首先，將抗人igm抗體和抗人igg抗體分別包被在不同熒光編碼磁性微球表面，形成微球-igm/g抗體復(fù)合物；其次，將微球-igm/g抗體復(fù)合物與待測樣品孵育，洗滌去除待測樣品中的未結(jié)合成分，形成微球-igm/g抗體-igm/g復(fù)合物；再次，加入生物素標(biāo)記的mp抗原和鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，形成微球-igm/g抗體-igm/g-mp抗原復(fù)合物；最后，經(jīng)儀器檢測熒光信號強(qiáng)度完成檢測。
8.優(yōu)選的，將抗人igm抗體和抗人igg抗體分別包被在不同熒光編碼磁性微球表面的包被比例為：20μg抗體包被5
×
106個熒光編碼磁性微球，抗體與熒光編碼磁性微球的孵育
條件為室溫避光震蕩1.5h。
9.優(yōu)選的，形成微球-igm/g抗體復(fù)合物后，利用離心管和磁力架對編碼熒光微球進(jìn)行洗滌和分離，去除未結(jié)合抗體。
10.優(yōu)選的，熒光編碼磁性微球?yàn)楣滔噍d體，其為具有羧基基團(tuán)的磁性聚苯乙烯熒光編碼微球，抗人igm抗體和抗人igg抗體分別共價(jià)偶聯(lián)于不同熒光編碼磁性微球表面，抗體偶聯(lián)微球分別與待測樣本、生物素標(biāo)記的mp抗原、鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白特異性結(jié)合，最終形成熒光免疫復(fù)合體，根據(jù)微球熒光類型和熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測分析。
11.優(yōu)選的，利用抗人igm/g抗體、mp-igm/g、生物素標(biāo)記的mp抗原、鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，偶聯(lián)了抗人igm抗體或抗人igg抗體的熒光微球首先與稀釋的待測樣品孵育，將其中igm或igg特異性結(jié)合，隨后與生物素標(biāo)記的mp抗原和鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白孵育。
12.優(yōu)選的，以藻紅蛋白作為熒光標(biāo)記物，微球、抗人igm/g抗體、mp-igm/g和mp抗原形成免疫復(fù)合體后，根據(jù)藻紅蛋白的熒光強(qiáng)度計(jì)算待測物含量。
13.優(yōu)選的，mp抗原與藻紅蛋白通過生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)連接。
14.優(yōu)選的，利用不同熒光編碼磁性微球進(jìn)行編碼區(qū)分，不同微球分別包被抗人igm抗體和抗人igg抗體，最終形成不同免疫復(fù)合物，用于同時檢測待測樣品中mp-igm和mp-igg的含量。
15.優(yōu)選的，所述微球-igm/g抗體復(fù)合物是通過活化熒光微球表面的羧基，將羧基與igm/g抗體上的氨基形成共價(jià)鍵，從而形成復(fù)合物。
16.優(yōu)選的，包括試劑盒以及放在試劑盒內(nèi)的多個藥劑盒，其中，具有放置不同熒光編碼磁性微球的藥劑盒，熒光編碼微球包含有分別包被抗人igm抗體和抗人igg抗體的熒光編碼微球；具有放置mp抗原溶液的藥劑盒，mp抗原溶液為生物素標(biāo)記mp抗原溶液，具有放置藻紅蛋白的藥劑盒，藻紅蛋白為鏈霉親和素標(biāo)記藻紅蛋白，具有放置標(biāo)準(zhǔn)品溶液的藥劑盒，準(zhǔn)品溶液為mp-igg和mp-igm標(biāo)準(zhǔn)品溶液，具有放置緩沖液的藥劑盒，所述緩沖液為ph7.4的pbs緩沖液，試劑盒里設(shè)有可發(fā)性聚苯乙烯泡沫層，試劑盒包括盒體與盒蓋，盒體與盒蓋由酚醛塑料材質(zhì)的連接軸連接，試劑盒底部預(yù)制有存放碎冰的冰槽。
17.有益效果：本發(fā)明可以同時檢測待測樣品中mp-igg和mp-igm含量，效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好，可在臨床檢測、流行病學(xué)調(diào)查等方面發(fā)揮重要作用；試劑盒使用可發(fā)性聚苯乙烯泡沫材質(zhì)，盒體與盒蓋由酚醛塑料材質(zhì)的連接軸連接，試劑盒底部預(yù)制有存放碎冰的冰槽。
附圖說明
18.圖1是本發(fā)明mp-igm檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
19.圖2是本發(fā)明mp-igg檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
20.以下結(jié)合說明書附圖1-2，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實(shí)施例。
21.為使本發(fā)明的目的、方法及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明確，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做
出詳細(xì)說明。
22.本發(fā)明一種基于流式熒光技術(shù)的肺炎支原體igm和igg的同步檢測方法的技術(shù)方案如下：
23.首先，將抗人igm抗體和抗人igg抗體分別包被在不同熒光編碼磁性微球表面，形成微球-igm/g抗體復(fù)合物，20μg抗體包被5
×
106個磁珠，抗體與微球的孵育條件為室溫避光震蕩1.5h。利用離心管和磁力架對編碼熒光微球進(jìn)行洗滌和分離，去除未結(jié)合抗體。其次，將微球-igm/g抗體復(fù)合物與待測樣品孵育，孵育條件為避光、37℃震蕩1h，洗滌去除待測樣品中的未結(jié)合成分，形成微球-igm/g抗體-igm/g復(fù)合物。再次，加入生物素標(biāo)記的mp抗原和鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，孵育條件為避光、37℃震蕩1h，形成微球-igm/g抗體-igm/g-mp抗原復(fù)合物，經(jīng)儀器檢測熒光信號強(qiáng)度完成檢測。
24.所述包被抗體是指抗人igm單克隆抗體和抗人igg單克隆抗體。所述微球-igm/g抗體復(fù)合物，是通過活化熒光微球表面的羧基[利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和n-羥基硫代琥珀酰亞胺(nhs)]，將其與igm/g抗體上的氨基形成共價(jià)鍵，從而形成復(fù)合物。所述的微球-igm/g抗體-igm/g-連接藻紅蛋白的mp抗原免疫復(fù)合物以及之前各步驟中形成的免疫復(fù)合物是指在每步孵育完成后利用離心和磁力架去除未結(jié)合成分后的物質(zhì)。所述樣品制備過程中的離心管和磁力架，可用酶標(biāo)板和96孔板磁力架替代。所述熒光檢測分析是指利用檢測儀器發(fā)射的兩束不同波長激發(fā)光照射免疫復(fù)合體，由熒光編碼微球的熒光類型確定檢測指標(biāo)類型、由藻紅蛋白的熒光強(qiáng)度確定檢測指標(biāo)含量。檢測儀器優(yōu)選tesmi f4000全自動流式熒光發(fā)光免疫分析儀。磁性微球優(yōu)選美國luminex生產(chǎn)。
[0025]
實(shí)施例1微球-人igm抗體偶聯(lián)
[0026]5×
106個微球?yàn)橐粋€批次，將其加入至1.5ml離心管中，依次加入edc和nhs溶液，在室溫、酸性條件下活化微球表面30min，隨后利用磁力架將微球置換至mes緩沖液中，加入30μg抗體，室溫避光震蕩1.5h，利用磁力架去除未過量的抗體，加入1％bsa，室溫避光震蕩30h以封閉未結(jié)合位點(diǎn)。
[0027]
實(shí)施例2制備生物素標(biāo)記mp抗原
[0028]
1mgmp抗原加入超濾管中，加入pbs緩沖液至0.5ml，12000g離心10min，超濾兩次，置換緩沖體系。加入13.3μlnh2-reactive biotin及適量pbs，使蛋白濃度達(dá)到2mg/ml，37℃避光孵育0.5h。超速離心，去除未結(jié)合生物素。
[0029]
實(shí)施例3包被igm抗體微球-igm-mp抗原-藻紅蛋白免疫復(fù)合物形成
[0030]
1.5ml離心管中加入微球-人igm抗體偶聯(lián)物，加入待測樣品溶液，37℃避光震蕩1h，利用磁力架將微球用pbs洗滌2次，加入生物素標(biāo)記的mp抗原和鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白，得到微球-igm抗體-igm抗原-藻紅蛋白熒光免疫復(fù)合物，并上機(jī)檢測。
[0031]
實(shí)施例4mp-igm、mp-igg檢測的線性范圍、靈敏度、特異性及精密度
[0032]
分別制備mp-igm和mp-igg標(biāo)準(zhǔn)品，利用本試劑盒進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用熒光值和濃度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，mp-igm線性方程為：y＝1028.4x+2174.2，r2＝0.9989，線性范圍為1u/ml～200u/ml，mp-igg線性方程為：y＝691.15x+4092.8，r2＝0.9988，線性范圍為1u/ml～300u/ml，結(jié)果圖1所示。
[0033]
平行測定10次0u/ml參考標(biāo)準(zhǔn)品的熒光值，并計(jì)算其均值(mean)及標(biāo)準(zhǔn)差(sd)，采用mean+2sd代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到本試劑盒對mp-igm的檢測靈敏度為0.34u/ml，對
mp-igg的檢測靈敏度為0.47u/ml。
[0034]
使用試劑盒同步檢測mp-igm、mp-igg標(biāo)準(zhǔn)品，以及0.5muhbsab、5ncu/mlhbeab，hbsab和hbeab結(jié)果均為陰性，結(jié)果表明本試劑盒與hbsab、hbeab無交差反應(yīng)。
[0035]
分別檢測mp-igm和mp-igg的低值樣本、中值樣本、高值樣本各10次，得到mp-igm批內(nèi)變異系數(shù)為2.18％-5.57％(＜10％)，批間變異系數(shù)為8.77％-11.15％(＜15％)。mp-igg批內(nèi)變異系數(shù)為3.14％-6.58％(＜10％)，批間變異系數(shù)為8.14％-12.63％。
[0036]
表1 mp-igm檢測精密度
[0037][0038]
表2 mp-igg檢測精密度
[0039][0040]
最后，需要注意的是，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有很多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容中直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述的實(shí)施例只用于說明本發(fā)明，而不是用于對本發(fā)明進(jìn)行限定，任何在本發(fā)明基礎(chǔ)上所做的修改、等同替換等也均在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。