本發(fā)明屬于尿中1-溴丙烷的檢測方法，具體涉及尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法。
背景技術(shù)：
：1-溴丙烷為無色液體，有刺激性氣味；分子量為122.99；蒸汽壓為16.39kpa/25℃；閃點為26℃；熔點為-110℃；沸點為70.9℃；不溶于水，溶于醇、醚、四氯化碳；相對密度(水=1)為1.36；相對密度(空氣=1)為4.3；化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；主要用作溶劑，常用于生產(chǎn)噴霧黏合劑、精密儀器的清洗劑和脫脂劑，也作為制藥產(chǎn)業(yè)、殺蟲劑和季胺類化合物合成的中間體。1-溴丙烷生產(chǎn)時的主要原料為正丙醇，其主要副產(chǎn)物為2-溴丙烷，因此職業(yè)接觸人群的尿中有可能含有正丙醇和2-溴丙烷,與2-溴丙烷相比,1-溴丙烷對精原細(xì)胞的毒性較小，但神經(jīng)毒性和抑制精子成熟的毒性較強(qiáng),且能損害人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近年來我國電子、農(nóng)藥、染料、醫(yī)藥、造紙、制革等產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，每年溴代烷烴的需求量超過14000t，其中高純度的i-bp為8000t。接觸工人數(shù)量大，從國外人群流行病學(xué)資料研究表明其短期大劑量接觸和長期接觸均可以對人體造成職業(yè)性損害，故其潛在隱患不容忽視。為切實做好i-bp中毒的三級預(yù)防，做到防患于未然，目前亟須在1-bp中毒機(jī)制、生物接觸限值及檢測、中毒診斷標(biāo)準(zhǔn)等諸多方面進(jìn)行深入研究，盡快制定尿中1-bp檢測標(biāo)準(zhǔn)。1-bp的代謝過程較為復(fù)雜,jonesar等人進(jìn)行1-bp毒代動力學(xué)動物實驗時，發(fā)現(xiàn)大部分1-bp可不經(jīng)過轉(zhuǎn)變以原型隨呼吸或尿液排出，染毒后100h25%的1-bp經(jīng)尿液排出，部分代謝為n-乙?；?s-(正丙基)-l-半胱氨酸（acprcys）及其相應(yīng)的氧化產(chǎn)物。另外，kawai等人在日本1-bp職業(yè)暴露人群中開展的研究，分析顯示職業(yè)暴露工人班后尿樣中1-bp濃度同外暴露量呈高度線性相關(guān)，同時未暴露1-bp的對照組工人，尿樣中均未檢出1-bp的存在，提示班后尿中1-bp可以很好地用于監(jiān)測1-bp暴露。目前，見諸報道的測定尿中1-bp的檢測方法均為頂空-氣相色譜法，區(qū)別在于所選用的頂空裝置和檢測器不同。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法，使用毛細(xì)管色譜柱，響應(yīng)值大，1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質(zhì)峰實現(xiàn)了較好分離，檢測時間短，靈敏度高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種尿中1-溴丙烷頂空氣相色譜測定方法，包括如下步驟：1）樣品溶液的配置：在頂空瓶中加入尿樣和無水硫酸鈉密封；2）標(biāo)樣溶液的配置：在頂空瓶中加入不同濃度的1-溴丙烷溶液和無水硫酸鈉密封；3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用頂空氣相色譜對多組標(biāo)樣溶液進(jìn)行分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；4）對樣品溶液進(jìn)行檢測：采用頂空氣相色譜對樣品溶液進(jìn)行分析，得到峰面積，將峰面積帶入標(biāo)樣曲線的回歸方程中，得到尿中1-溴丙烷的濃度。步驟2）中1-溴丙烷溶液濃度從0μg/l開始，以20~100μg/l遞增至1000μg/l。步驟3）和4）所述頂空氣相色譜中頂空進(jìn)樣器的平衡溫度為80~100℃，平衡時間為5~15min。步驟3）和4）所述頂空氣相色譜中色譜條件為：進(jìn)樣口溫度200℃,柱溫55℃，保持2min，再以15℃/min升至130℃，保持1min;以6∶1的分流比進(jìn)樣;載氣高純氦氣;柱流量1ml/min。電離方式ei，離子源溫度230℃;輔助接口溫度280℃;電子轟擊電壓70ev;掃描方式單離子檢測掃描。無水硫酸鈉的用量為0.05~0.5g/每毫升尿樣。頂空瓶中加無水硫酸鈉可提高1-bp在頂空相中濃度以提高實驗靈敏度。色譜柱選擇毛細(xì)管色譜柱，所述檢測器為氫火焰離子檢測器。色譜柱為peg-20m石英毛細(xì)管柱或者h(yuǎn)p-5ms石英毛細(xì)柱。色譜柱為peg-20m石英毛細(xì)管柱時優(yōu)選平衡溫度為100℃，平衡時間為8min。色譜柱為hp-5ms石英毛細(xì)柱時優(yōu)選平衡溫度為90℃，平衡時間為10min。本發(fā)明選用色譜柱hp-5ms，與hp-5相比，hp-5色譜柱固定相為：（5%）-二苯基（95%）-二甲基聚硅氧烷；而hp-5ms柱的固定相為：（5%）-二苯基（95%）-二甲基亞芳基硅氧烷共聚物，兩者相差了“亞芳基”，因此hp-5ms具有更好的熱穩(wěn)定性，流失降低，基線低，響應(yīng)好。有益效果：本發(fā)明使用peg-20m石英毛細(xì)管柱或者h(yuǎn)p-5ms石英毛細(xì)管色譜柱，熱穩(wěn)定性好，1-bp響應(yīng)值大，且1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質(zhì)峰實現(xiàn)了較好分離，出峰時間短，靈敏度高，檢測時間短。應(yīng)用本方法經(jīng)河南省職業(yè)病防治院、深圳市職業(yè)病防治院、揚州市疾病預(yù)防控制中心三家單位的方法驗證，檢出限低至2.0μg/l，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0-8.5，精密度高，批內(nèi)精密度為2.4％～5.7％，批間精密度為4.8％～6.6％。本法使用的儀器和試劑，在國內(nèi)職業(yè)衛(wèi)生監(jiān)測實驗室較普及。附圖說明圖1頂空溫度選擇實驗結(jié)果；圖2頂空平衡時間選擇實驗結(jié)果；圖3尿中1-bp測定的工作曲線圖；圖41-bp測定干擾試驗色譜圖；圖5尿中1-bp穩(wěn)定性實驗結(jié)果。具體實施方式以下實施例中，頂空氣相色譜中色譜條件為：進(jìn)樣口溫度200℃,柱溫55℃，保持2min，再以15℃/min升至130℃，保持1min;以6∶1的分流比進(jìn)樣;載氣高純氦氣;柱流量1ml/min。電離方式ei，離子源溫度230℃;輔助接口溫度280℃;電子轟擊電壓70ev;掃描方式單離子檢測掃描。頂空瓶中尿樣與無水硫酸鈉的用量關(guān)系為每毫升尿樣加入0.5g無水硫酸鈉。實施例1本實施例說明色譜柱的選擇分別試驗了hp-5、hp-1、hp-ffap、peg-20m、hp-5ms柱等不同毛細(xì)管色譜柱及色譜條件測定尿中1-bp，結(jié)果表明，使用hp-ffap、peg-20m、hp-5ms毛細(xì)管色譜柱，1-bp和溶劑峰及尿樣中其他雜質(zhì)峰實現(xiàn)了較好分離，其中peg-20m、hp-5ms的分離時間更短，出峰穩(wěn)定，峰形好，靈敏度更高。頂空溫度選擇：分別在60℃、70℃、80℃、90℃、100℃條件下，對尿樣（100μg/l）進(jìn)行測定，均恒溫10min，結(jié)果表明，采用peg-20m石英毛細(xì)管柱，在100℃時1-bp響應(yīng)到達(dá)最大值，110℃時開始顯著下降，故選擇100℃作為頂空溫度，在頂空溫度為100℃，振搖速率為250rpm的條件下，對尿樣（100μg/l）進(jìn)行測定，在平衡時間為4、8、10、20min分別進(jìn)樣，8min后峰面積不再增加，故選擇平衡時間為8min。采用hp-5ms石英毛細(xì)柱，在90℃時1-bp響應(yīng)到達(dá)最大值，故選擇90℃作為頂空溫度，見圖1。在頂空溫度為90℃，振搖速率為250rpm的條件下，對尿樣（100μg/l）進(jìn)行測定，在平衡時間為5、10、15、20min分別進(jìn)樣，10min后峰面積不再增加，故選擇平衡時間為10min，見圖2。尿樣成分復(fù)雜，水占96%-97%，其他為尿素，尿酸，肌酐，氨等非蛋白氮化合物、硫酸鹽等成分，1-溴丙烷含量低微，由于填充柱柱效低，采用填充柱很難使各組分完全分離，且峰形寬，只能檢出少量組分，結(jié)果不理想。因此我們選用石英毛細(xì)管色譜柱。1-溴丙烷與2-溴丙烷分子量相近，只在結(jié)構(gòu)上稍有差異，采用弱極性和中等極性的色譜柱不能使它們完全分離，而選用強(qiáng)極性的peg-20m毛細(xì)管色譜柱，并用程序升溫技術(shù)，能有效地把各組分分離，達(dá)到了較為理想的效果，以下實施例中均采用peg-20m毛細(xì)管色譜柱測定。實施例2本實施例說明檢出范圍及檢出限采用1-bp(德國dr.ehrenstorfer公司，純度98%)配置濃度為0、20、40、60、100、200、500、1000μg/l的標(biāo)準(zhǔn)系列，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積平均值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=34.0x-14.6（r=0.9992）（見圖3所示）；檢出限確定采用噪聲法，3倍噪聲對應(yīng)的檢出限濃度為2μg/l，定量下限為10μg/l。配制10μg/l尿樣做準(zhǔn)確度、精密度實驗，回收率為98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.1%，見圖3。實施例3本實施了說明檢測準(zhǔn)確度及精密度制備工作曲線范圍內(nèi)低中高三種濃度100、200、500μg/l的加標(biāo)尿樣（內(nèi)標(biāo)1-bb），每種濃度6份，當(dāng)天測定，連續(xù)測定3d，計算平均回收率和精密度。結(jié)果，高、中、低濃度樣品的加標(biāo)回收率為96.8％～104.8％，批內(nèi)精密度為2.4％～5.7％，批間精密度為4.8％～6.6％，見表1。均符合《生物材料分析方法的研制準(zhǔn)則》的要求。表1　方法的平均回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6），%加標(biāo)100μg/l加標(biāo)200μg/l加標(biāo)500μg/lrecovery104.896.8100.9rsd（批內(nèi)）4.62.45.7rsd（批間）6.64.86.4干擾試驗：在加標(biāo)尿樣（100μg/l）中分別加入微量正丙醇(主要生產(chǎn)原料)和2-溴丙烷（主要副產(chǎn)物），按照樣品測定過程進(jìn)行檢測，結(jié)果表明上述化合物不干擾尿中1-溴丙烷的測定，且分離效果好，見圖4。樣品穩(wěn)定性試驗：配制濃度為1000μg/l尿樣36份，分為6組，每組6份，分別在0h、8h、24h、3d、7d、14d測定，結(jié)果表明，現(xiàn)場采集尿樣、壓緊頂空瓶蓋后至少可以保存7d，見圖5。本發(fā)明提供的方法，經(jīng)河南省職業(yè)病防治院、深圳市職業(yè)病防治院、揚州市疾病預(yù)防控制中心三家單位的方法驗證。驗證結(jié)果見表2。表2三家單位驗證結(jié)果當(dāng)前第1頁12