本發(fā)明涉及生化檢測(cè)領(lǐng)域，具體的，涉及一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑測(cè)定試劑及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase)是一種利用還原型nad(p)將氧化型谷胱甘肽(gs－sg)催化反應(yīng)成還原型(gsh)的酶。

在動(dòng)植物組織、微生物、酵母中均可以見到，其反應(yīng)是不可逆的。

鼠肝臟的酶幾乎只能利用nadp作為補(bǔ)酶，但是在人的紅血球的酶也利用nad進(jìn)行作用。對(duì)胱氨酸和高胱氨酸均無作用?？蓮慕湍钢兄迫〗Y(jié)晶物。植物組織中似乎可對(duì)脫氫酶和氧化酶的連結(jié)起作用。將谷胱甘肽還原酶gs－sg、nadp和葉綠體混合一起用光照射，就會(huì)放氧，這就是受人重視的希爾(hill)反應(yīng)。大腸桿菌這種酶中含有黃素。

谷胱甘肽是一種重要的細(xì)胞抗氧化劑。缺失谷胱甘肽還原酶會(huì)使細(xì)胞對(duì)氧化劑和抗生素更為敏感。

傳統(tǒng)的檢測(cè)方法使用復(fù)溶液加干粉，試劑現(xiàn)溶現(xiàn)用，穩(wěn)定性差，不適于全自動(dòng)分析的要求，因此有必要開發(fā)一種新的具有良好穩(wěn)定性和檢測(cè)準(zhǔn)確性的谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于克服傳統(tǒng)的谷胱甘肽還原酶測(cè)定方法存在的穩(wěn)定性差的缺陷，提供一種在2-8℃開蓋使用狀態(tài)下和在2-8℃密閉避光存儲(chǔ)條件下持續(xù)穩(wěn)定的谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑的制備方法和在測(cè)定中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑，所述試劑包括試劑1和試劑2，所述試劑1的組成成分包括：緩沖液、氧化型谷胱甘肽、穩(wěn)定劑a；試劑2的組成成分包括：緩沖液、還原型輔酶ⅱ、穩(wěn)定劑b；所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液中的任一種；所述穩(wěn)定劑a為乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、山梨酸鉀中的一種或兩種以上的混合物；所述穩(wěn)定劑b為蔗糖、抗壞血酸、牛血清白蛋白、山梨酸鉀中的一種或兩種以上的混合物。

其中：

所述試劑1中，氧化型谷胱甘肽的濃度為0.1-1mmol/l；緩沖液的終濃度為50-100mmol/l；穩(wěn)定劑a的濃度為1-2g/l。

所述試劑2中，還原型輔酶ⅱ的濃度為0.1-1g/l；緩沖液的終濃度為100-500mmol/l；穩(wěn)定劑b的濃度為1-10g/l。

進(jìn)一步的技術(shù)方案：

還包括校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品的組成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定劑c，所述基質(zhì)為緩沖液、酪蛋白、牛血清白蛋白中的一種或兩種以上的混合物，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷緩沖液、甘氨酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、碳酸鹽緩沖液中的任一種；所述純品為谷胱甘肽還原酶；所述穩(wěn)定劑c為海藻糖、抗壞血酸、乙二胺四乙酸二鈉中的一種兩種以上的混合物。

其中：

在所述校準(zhǔn)品中純品的濃度為30-100u/l；穩(wěn)定劑c的濃度為1-10g/l；當(dāng)所述基質(zhì)中含有緩沖液時(shí)，緩沖液的濃度為50-100mmol/l；當(dāng)所述基質(zhì)中含有酪蛋白時(shí)，酪蛋白的濃度為1-10g/l；當(dāng)所述基質(zhì)中含有牛血清白蛋白時(shí)，牛血清白蛋白的濃度為1-10g/l。

更進(jìn)一步的：

所述試劑1的ph為7.0-8.0，試劑2的ph為9.0-10.0。

所述校準(zhǔn)品的ph為7.5-8.0。

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑的制備方法，包括如下步驟：

a)試劑1的配制：試劑1的制備過程中各成分的混合順序沒有特別要求，在室溫條件下，直接將所述緩沖液、氧化型谷胱甘肽、穩(wěn)定劑a進(jìn)行同時(shí)、分批或分步混合，只要能得到均勻的穩(wěn)定相即可，通過攪拌使混合更加均勻；

b)試劑2的配制：試劑2的配制是在室溫條件下，按照緩沖液、穩(wěn)定劑b、還原型輔酶ⅱ的順序，依次混合，得到均勻的穩(wěn)定相，通過攪拌使混合更加均勻；

c)校準(zhǔn)品的配制：校準(zhǔn)品的配制是在室溫條件下，按照基質(zhì)、穩(wěn)定劑c、純品的順序，依次混合，得到均勻的穩(wěn)定相，通過攪拌使混合更加均勻。

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑在谷胱甘肽還原酶測(cè)定中的應(yīng)用，包括如下步驟：將待測(cè)樣本、試劑1、試劑2按照6μl：150μl：50μl的體積比(可根據(jù)試劑中主要成分的濃度和檢測(cè)儀器的不同，按比例進(jìn)行用量的調(diào)整)混勻后靜置180-300秒，然后置于檢測(cè)儀器中測(cè)量2-3分鐘吸光度值(a)，計(jì)算每分鐘吸光度變化率(△a/min)，其中：測(cè)試溫度37℃、檢測(cè)儀器主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm，光徑1cm，使用純化水和校準(zhǔn)品進(jìn)行線性校準(zhǔn)，測(cè)量待測(cè)樣本中谷胱甘肽還原酶的濃度。

其中：

所述待測(cè)樣本為血清、血漿、校準(zhǔn)品、質(zhì)控品或其他含有谷胱甘肽還原酶的溶液，所述檢測(cè)儀器為具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀。

由于上述技術(shù)方案的應(yīng)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1、通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑在2-8℃開蓋使用狀態(tài)下的穩(wěn)定時(shí)間可以達(dá)到20-30天，在2-8℃密閉避光存儲(chǔ)過程中的穩(wěn)定時(shí)間可以達(dá)到10-15個(gè)月。

2、該發(fā)明使用方便、消除干擾明顯、靈敏度高，對(duì)生化儀器管道無污染，使其在谷胱甘肽還原酶的準(zhǔn)確、快速測(cè)定中有重要的意義。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但本發(fā)明并不限于下述實(shí)施例。

實(shí)施例一

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑，所述試劑包括試劑1和試劑2，所述試劑1的組成成分包括：緩沖液、氧化型谷胱甘肽、穩(wěn)定劑a，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液，其終濃度為50mmol/l，所述穩(wěn)定劑a為乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、山梨酸鉀的混合物，其中乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂和山梨酸鉀的終濃度分別為1.5g/l，氧化型谷胱甘肽終濃度為0.5mmol/l；試劑2的組成成分包括：緩沖液、還原型輔酶ⅱ、穩(wěn)定劑b，所述緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液，其終濃度為250mmol/l，穩(wěn)定劑b為蔗糖、抗壞血酸、牛血清白蛋白、山梨酸鉀的混合物，其中蔗糖、抗壞血酸、牛血清白蛋白、山梨酸鉀的終濃度分別為5g/l，還原型輔酶ⅱ終濃度為0.5g/l；

該試劑還包括校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品的組成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定劑c，所述基質(zhì)為緩沖液、酪蛋白和牛血清白蛋白的混合物，其中緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液，其終濃度為50mmol/l，所述酪蛋白、牛血清白蛋的終濃度分別為5g/l；所述純品為谷胱甘肽還原酶，其終濃度為80u/l；所述穩(wěn)定劑c為海藻糖、抗壞血酸的混合物，所述海藻糖、抗壞血酸終濃度分別為5g/l。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑的制備方法，包括如下步驟：

a)試劑1的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用磷酸鹽緩沖液，其終濃度為50mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的磷酸鹽加入，調(diào)節(jié)ph為7.5，按配制體積計(jì)算并稱取適量的氧化型谷胱甘肽加入，終濃度為0.5mmol/l；按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的乙二胺四乙酸二鈉、氯化鎂、山梨酸鉀加入，終濃度分別為1.5g/l，攪拌均勻，即為試劑1。

b)試劑2的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用三羥甲基氨基甲烷緩沖液，終濃度為250mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的三羥甲基氨基甲烷加入，調(diào)節(jié)ph為9.5，按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的蔗糖、抗壞血酸、牛血清白蛋白、山梨酸鉀加入，終濃度分別為5g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的還原型輔酶ⅱ加入，終濃度為0.5g/l，攪拌均勻，即為試劑2。

c)校準(zhǔn)品的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用三羥甲基氨基甲烷緩沖液，終濃度為50mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的三羥甲基氨基甲烷加入，調(diào)節(jié)ph為7.5，按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的酪蛋白、牛血清白蛋白加入，終濃度分別為5g/l，按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的海藻糖、抗壞血酸加入，終濃度分別為5g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的谷胱甘肽還原酶純品加入，終濃度為80u/l，攪拌均勻，即為校準(zhǔn)品。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑在谷胱甘肽還原酶測(cè)定中的應(yīng)用，包括如下步驟：將待測(cè)樣本、試劑1、試劑2按照6μl：150μl：50μl的體積比混勻后靜置240秒，然后置于檢測(cè)儀器中測(cè)量2.5分鐘吸光度值(a)，計(jì)算每分鐘吸光度變化率(△a/min)，其中：測(cè)試溫度37℃、檢測(cè)儀器主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm，光徑1cm，使用純化水和校準(zhǔn)品進(jìn)行線性校準(zhǔn)，按公式：谷胱甘肽還原酶的濃度(u/l)＝c標(biāo)準(zhǔn)*(△a/min樣本-△a/min空白)/(△a/min標(biāo)準(zhǔn)-△a/min空白)計(jì)算樣本中谷胱甘肽還原酶的濃度，其中所述待測(cè)樣本為血清，所述檢測(cè)儀器為具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀。

實(shí)施例二

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑，所述試劑包括試劑1和試劑2，所述試劑1的組成成分包括：緩沖液、氧化型谷胱甘肽、穩(wěn)定劑a，所述緩沖液為碳酸鹽緩沖液，其終濃度為80mmol/l，所述穩(wěn)定劑a為氯化鎂，其終濃度為1g/l，氧化型谷胱甘肽終濃度為1mmol/l；試劑2的組成成分包括：緩沖液、還原型輔酶ⅱ、穩(wěn)定劑b，所述緩沖液為甘氨酸緩沖液，其終濃度為500mmol/l，穩(wěn)定劑b為蔗糖，其終濃度為1g/l，還原型輔酶ⅱ終濃度為1g/l；

該試劑還包括校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品的組成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定劑c，所述基質(zhì)為緩沖液和牛血清白蛋白的混合物，其中緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液，其終濃度為80mmol/l，所述牛血清白蛋的終濃度分別為1g/l；所述純品為谷胱甘肽還原酶，其終濃度為100u/l；所述穩(wěn)定劑c為海藻糖，所述海藻糖的濃度為10g/l。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑的制備方法，包括如下步驟：

a)試劑1的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用碳酸鹽緩沖液，其終濃度為80mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的碳酸鹽加入，調(diào)節(jié)ph為7，按配制體積計(jì)算并稱取適量的氧化型谷胱甘肽加入，終濃度為1mmol/l；按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的氯化鎂，其終濃度分別為1g/l，攪拌均勻，即為試劑1。

b)試劑2的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用甘氨酸緩沖液緩沖液，終濃度為500mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的甘氨酸緩沖液加入，調(diào)節(jié)ph為9，按配制體積計(jì)算并稱取適量的蔗糖加入，其濃度分別為1g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的還原型輔酶ⅱ加入，終濃度為1g/l，攪拌均勻，即為試劑2。

c)校準(zhǔn)品的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用三羥甲基氨基甲烷緩沖液，終濃度為80mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的三羥甲基氨基甲烷加入，調(diào)節(jié)ph為7，按配制體積計(jì)算并稱取適量的牛血清白蛋白加入，其終濃度為1g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的海藻糖，終濃度為10g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的谷胱甘肽還原酶純品加入，終濃度為100u/l，攪拌均勻，即為校準(zhǔn)品。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑在谷胱甘肽還原酶測(cè)定中的應(yīng)用，包括如下步驟：將待測(cè)樣本、試劑1、試劑2按照6μl：150μl：50μl的體積比混勻后靜置180秒，然后置于檢測(cè)儀器中測(cè)量2分鐘吸光度值(a)，計(jì)算每分鐘吸光度變化率(△a/min)，其中：測(cè)試溫度37℃、檢測(cè)儀器主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm，光徑1cm，使用純化水和校準(zhǔn)品進(jìn)行線性校準(zhǔn)，按公式：谷胱甘肽還原酶的濃度(u/l)＝c標(biāo)準(zhǔn)*(△a/min樣本-△a/min空白)/(△a/min標(biāo)準(zhǔn)-△a/min空白)計(jì)算樣本中谷胱甘肽還原酶的濃度，其中所述待測(cè)樣本為血漿，所述檢測(cè)儀器為具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀。

實(shí)施例三

一種谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑，所述試劑包括試劑1和試劑2，所述試劑1的組成成分包括：緩沖液、氧化型谷胱甘肽、穩(wěn)定劑a，所述緩沖液為檸檬酸緩沖液，其終濃度為100mmol/l，所述穩(wěn)定劑a為乙二胺四乙酸二鈉和山梨酸鉀的混合物，其中乙二胺四乙酸二鈉和山梨酸鉀的終濃度分別為2g/l，氧化型谷胱甘肽終濃度為0.1mmol/l；試劑2的組成成分包括：緩沖液、還原型輔酶ⅱ、穩(wěn)定劑b，所述緩沖液為檸檬酸緩沖液，其終濃度為100mmol/l，穩(wěn)定劑b為蔗糖和山梨酸鉀的混合物，其中蔗糖和山梨酸鉀的終濃度分別為10g/l，還原型輔酶ⅱ終濃度為0.1g/l；

該試劑還包括校準(zhǔn)品，所述校準(zhǔn)品的組成成分包括基質(zhì)、純品及穩(wěn)定劑c，所述基質(zhì)為酪蛋白和牛血清白蛋白的混合物，所述酪蛋白、牛血清白蛋的終濃度分別為1g/l和10g/l；所述純品為谷胱甘肽還原酶，其終濃度為30u/l；所述穩(wěn)定劑c為抗壞血酸、乙二胺四乙酸的混合物，所述抗壞血酸、乙二胺四乙酸終濃度分別為1g/l。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑的制備方法，包括如下步驟：

a)試劑1的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用檸檬酸緩沖液緩沖液，其終濃度為100mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的檸檬酸加入，調(diào)節(jié)ph為8，按配制體積計(jì)算并稱取適量的氧化型谷胱甘肽加入，終濃度為0.1mmol/l；按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的乙二胺四乙酸二鈉和山梨酸鉀加入，終濃度分別為2g/l，攪拌均勻，即為試劑1。

b)試劑2的配制：量取配制體積等體積的純化水，選用檸檬酸緩沖液緩沖液，終濃度為250mmol/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的檸檬酸加入，調(diào)節(jié)ph為10，按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的蔗糖和山梨酸鉀加入，終濃度分別為10g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的還原型輔酶ⅱ加入，終濃度為0.1g/l，攪拌均勻，即為試劑2。

c)校準(zhǔn)品的配制：量取配制體積等體積的純化水，稱取適量的酪蛋白、牛血清白蛋白加入，所述酪蛋白、牛血清白蛋的終濃度分別為1g/l和10g/l，調(diào)節(jié)ph為8，按配制體積計(jì)算并分別稱取適量的抗壞血酸和乙二胺四乙酸加入，終濃度分別為1g/l，按配制體積計(jì)算并稱取適量的谷胱甘肽還原酶純品加入，終濃度為30u/l，攪拌均勻，即為校準(zhǔn)品。

上述谷胱甘肽還原酶測(cè)定試劑在谷胱甘肽還原酶測(cè)定中的應(yīng)用，包括如下步驟：將待測(cè)樣本、試劑1、試劑2按照6μl：150μl：50μl的體積比混勻后靜置300秒，然后置于檢測(cè)儀器中測(cè)量3分鐘吸光度值(a)，計(jì)算每分鐘吸光度變化率(△a/min)，其中：測(cè)試溫度37℃、檢測(cè)儀器主波長(zhǎng)340nm、副波長(zhǎng)405nm，光徑1cm，使用純化水和校準(zhǔn)品進(jìn)行線性校準(zhǔn)，按公式：谷胱甘肽還原酶的濃度(u/l)＝c標(biāo)準(zhǔn)*(△a/min樣本-△a/min空白)/(△a/min標(biāo)準(zhǔn)-△a/min空白)計(jì)算樣本中谷胱甘肽還原酶的濃度，其中所述待測(cè)樣本為血清，所述檢測(cè)儀器為具有雙試劑功能的全自動(dòng)生化分析儀。

以上所述是本實(shí)用新型的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實(shí)用新型所述原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)或替換，這些改進(jìn)或替換也應(yīng)視為發(fā)明的保護(hù)范圍。