本發(fā)明涉及一種棉花耐低鉀種質的鑒定方法，屬于棉花種植技術領域。

背景技術：

棉花作為我國重要的經(jīng)濟作物和戰(zhàn)略物資，在國民經(jīng)濟中占有很重要的地位(喻樹迅等,2000)。但棉花由于生長周期長，生物量大，棉鈴鉀含量高的生物特性，使其對鉀的需求總量很高。然而棉花的根系相對弱小，從土壤中吸收鉀素的能力偏低，所以棉花要比其他大田作物對于低鉀更為敏感(cassmanetal.,1990；田曉莉等,2008)。近年來，隨著棉花復種指數(shù)和產(chǎn)量水平的逐步提高，我國棉花生產(chǎn)中的缺鉀現(xiàn)象越來越普遍、缺鉀程度也越來越嚴重(yangetal.,2011)。此外，由于不合理的肥料運籌，我國棉花生產(chǎn)中的缺鉀現(xiàn)象進一步加劇，常常導致早衰并嚴重影響產(chǎn)量提高和品質改善(董合忠等,2005)。土壤缺鉀以及鉀肥短缺已經(jīng)成為制約我國農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要限制因素，因此選育鉀高效吸收的品種是解決這一問題的有效途徑之一。

根系作物吸收養(yǎng)分的主要器官，也是養(yǎng)分進入作物體內的第一道障礙。鉀高效基因型一般具有較好的k⁺吸收速率：如發(fā)達的根系、高的吸收能力等特點(yangetal.,2011；wangetal.,2012)；如何快速有效的篩選k⁺吸收速率較高的材料，是棉花育種工作的重要工作內容之一。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種棉花耐低鉀種質的鑒定方法，該方法利用不同耐低鉀性棉花品種在k⁺吸收速率上具有明顯差異的性質，采用非損傷微測技術(nmt)快速、準確的鑒定棉花品種的耐低鉀性，具有一定的實用價值。

本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種棉花耐低鉀種質的鑒定方法，包括如下步驟：

(1)將棉花種子平分兩部分，分別進行水培培養(yǎng)和蛭石培養(yǎng)各6天；選擇生長整齊的幼苗，用刀片分別切取水培條件下幼苗中上部根系及蛭石培養(yǎng)條件下主根根系作為待測樣品；

同時，以耐低鉀材料中571和鉀敏感品種新棉99b分別作為耐低鉀對照樣品和鉀敏感對照樣品；

(2)將待測樣品及對照樣品分別先用去離子水沖洗干凈，浸沒于蒸餾水中，再浸入測試液中平衡；

(3)將步驟(2)處理好的待測樣品及對照樣品分別轉入新的測試液中，采用非損傷性微測技術(nmt)測定低鉀脅迫6天(水培培養(yǎng))和發(fā)苗6天(蛭石培養(yǎng))棉花幼苗的鉀離子流速；

(4)通過比較待測組織樣品與對照樣品的鉀離子流速，判斷所述棉花種子是否為耐低鉀性較強的棉花種質材料。

其中，各步驟具體條件如下：

步驟(1)中，所述耐低鉀材料(中571)和鉀敏感品種(新棉99b)均由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供；

步驟(1)中，水培及蛭石培養(yǎng)條件：在光照(鈉燈)培養(yǎng)室內進行，光照強度為450μmolm^-2s^-1，光照時間為14h，白天溫度為28±2℃，夜間溫度為20±2℃。

步驟(1)中，具體培養(yǎng)方法為：將種子用9％的雙氧水消毒30min，清水漂洗數(shù)次后種子平分為兩部分；

一部分種子均勻播于用去離子水沖洗過的沙床，上面蓋一層滌綸布后再覆薄沙一層，4d后將幼苗轉移至體積為32cm×26cm×32cm的塑料方盒中，用含k⁺離子為0.1mm改良的hoagland營養(yǎng)液進行低鉀脅迫培養(yǎng)，對比排列，每處理重復6盒；

改良的hoagland營養(yǎng)液配方為：2.5mmca(no3)2,1mmmgso4,0.5mm(nh4)h2po4,0.1mmfe-na-edta,0.2μmcuso4,1μmznso4,20μmh3bo3,5pm(nh4)6mo7o24,1μmmnso4和0.1mmkcl。

另一部分種子播種于盛有去離子水洗過蛭石的紙杯中(10cm×12cm)，每天適量噴水保持蛭石的濕度；

步驟(3)中，測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0。

步驟(3)中，測定部位：水培條件下幼苗根系的測定部位距根尖300-600μm，優(yōu)選300μm處；蛭石培養(yǎng)條件下幼苗的測試部位距根尖600-800μm，優(yōu)選600μm。

步驟(3)中，待測試環(huán)境達到穩(wěn)定狀態(tài)后測試時間持續(xù)5～8min。

步驟(4)中，所述判斷的方法具體為：

a、若待測組織樣品的k⁺離子保留或吸收能力顯著低于鉀敏感品種xm99b，則屬于鉀極敏感材料；

b、若待測組織樣品的k⁺離子保留或吸收能力與鉀敏感品種xm99b無顯著差異，則屬于鉀敏感材料；

c、若待測組織樣品的k⁺離子保留或吸收能力顯著高于鉀敏感品種xm99b，而低于耐低鉀材料z571，則屬于中等耐低鉀材料；

d、若待測組織樣品的k⁺離子保留或吸收能力與耐低鉀材料z571無顯著差異，則屬于耐低鉀材料；

e、若待測組織樣品的k⁺離子保留或吸收能力顯著高于耐低鉀材料z571，則屬于強耐低鉀材料。

本發(fā)明通過測定不同的生長環(huán)境中(低鉀脅迫水培和蛭石)培養(yǎng)的幼苗根系不同部位的k⁺離子流，建立了一種快速、高效的室內鑒定棉花幼苗鉀吸收能力的方法，具有一定的實用價值。

附圖說明

圖1為低鉀脅迫條件下z571與xm99b的耐低鉀能力示意圖。

圖2為低鉀脅迫處理對不同棉花幼苗的干物質和鉀離子的累積的影響。

圖3為低鉀脅迫處理6天后不同材料棉花幼苗根中k⁺離子的動態(tài)變化。

圖4為蛭石中培養(yǎng)6天的幼苗主根中k⁺離子的動態(tài)變化。

圖5為實施例1中低鉀脅迫6天(水培培養(yǎng))幼苗根系的k⁺離子流。

圖6為實施例1中發(fā)苗6天(蛭石培養(yǎng))幼苗根系的k⁺離子流。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

1.材料與方法

供試材料為耐低鉀材料中571(z571)和鉀敏感品種新棉99b(xm99b)，種子均由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供；

試驗條件：試驗在光照(鈉燈)培養(yǎng)室內進行，光照強度為450μmolm^-2s^-1，光照時間為14h，白天溫度為28℃±2℃，夜間溫度為20℃±2℃。

種子用9％的雙氧水消毒30min，清水漂洗數(shù)次后種子分為兩部分。一部分種子均勻播于用去離子水沖洗過的沙床，上面蓋一層滌綸布后再覆薄沙一層。4d后將幼苗轉移至體積為32cm×26cm×32cm的塑料方盒中，用含k⁺離子為0.1mm改良的hoagland營養(yǎng)液進行低鉀脅迫培養(yǎng)，對比排列，每處理重復6盒。

改良的hoagland營養(yǎng)液配方為：2.5mmca(no3)2,1mmmgso4,0.5mm(nh4)h2po4,0.1mmfe-na-edta,0.2μmcuso4,1μmznso4,20μmh3bo3,5pm(nh4)6mo7o24,1μmmnso4和0.1mmkcl。

低鉀脅迫處理3天、6天和9天后，測定其干物質累積和鉀離子含量；同時低鉀脅迫6天后，采用非損傷性微測技術(nmt)測定不同材料的鉀離子流速。

另一部分種子播種于盛有去離子水洗過蛭石的紙杯中(10cm×12cm)，每天適量噴水保持蛭石的濕度，發(fā)苗6天后，采用非損傷性微測技術(nmt)測定不同材料的鉀離子流速。

干物質量和k⁺含量的測定；取待測植株，先用去離子水浸泡10min后，再用蒸餾水沖洗干凈，并用吸水紙吸去表面附著的水分。將幼苗根及地上部(莖和葉)分開，分別于105℃殺青30min后，80℃下烘直至恒重，稱其干物質量。將烘干后的植株粉碎過篩，用1moll^-1hcl浸提12h并振蕩30min后過濾，用原子吸收分光光度計(spectaa-50/55,varian,australia)測定k⁺濃度。

離子流速測定；在旭月(北京)科技有限公司采用非損傷微測技術(bio-001a,youngerusasci.&tech.corp.,amherst,ma,usa)測定幼苗根系k⁺離子流速；選生長整齊的棉花幼苗，用刀片從幼苗根部切取部分根系(～3cm)作為根組織樣品；將測定的樣品用去離子水沖洗干凈，并將其浸沒在蒸餾水15min，浸入20ml測試液中平衡15min，再轉入新的20ml測試液中開始測試。測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0；每處理測定8株幼苗，測試持續(xù)7～10min(達到穩(wěn)定狀態(tài))，計算時舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計；所有實驗至少獨立重復3次，各次結果趨勢一致，取其中具有代表性的數(shù)值進行統(tǒng)計分析。采用spss16.0(spssinc.chicago,usa)處理數(shù)據(jù)，以duncan’s多重比較進行差異顯著性檢驗(p<0.05)。

2.結果與分析

2.1低鉀脅迫條件下z571的耐低鉀能力要高于xm99b；如圖1所示，低鉀脅迫20天，鉀敏感品種xm99b葉片黃化且出現(xiàn)明顯的干枯斑點；而耐低鉀材料z571的葉片保持正常的形態(tài)。

2.2低鉀脅迫處理影響不同棉花幼苗的干物質和鉀離子的累積(見圖2)。低鉀脅迫處理3天和6天，不同材料幼苗的干物質累積無顯著差異；低鉀脅迫處理9天后，不同材料幼苗的地上部干物質累積無顯著差異，但z571的根部干物質累積要顯著高于xm99b。低鉀脅迫處理3天，不同材料幼苗的鉀離子含量無顯著差異；但低鉀脅迫處理6天和9天后，z571的根部和地上部中鉀離子含量均要顯著高于xm99b。

2.3進一步明確低鉀脅迫對棉花幼苗離子吸收的影響，通過非損傷微測技術(nmt)測定低鉀脅迫處理6天后不同材料棉花幼苗根中k⁺離子的動態(tài)變化。為明確最佳的測定部位，首先測定了距根尖0-2000μm范圍的主根中k⁺離子流的變化情況；如圖3所示，棉花幼苗的k⁺離子流呈外排狀態(tài)，且離根尖越遠k⁺離子外排速率越高，但不同材料間k⁺離子速率無顯著差異；棉花幼苗的k⁺離子速率在0-600μm范圍中外排較低，為此選用距根尖300μm處作為后續(xù)工作的測定部位。隨后測定了距根尖300μm處的主根和上部側根中k⁺離子流速；結果表明，主根與測定中k⁺離子均為外排，且側根中k⁺離子外排速率高于主根中k⁺離子外排速率；不同材料中比較，主根中k⁺離子外排速率品種間無顯著差異，而z571的側根中k⁺離子外排速率顯著低于xm99b的側根，即z571的側根保留k⁺離子能力強于xm99b的側根。

2.4與此同時，測定了在蛭石中培養(yǎng)6天的幼苗主根中k⁺離子的動態(tài)變化；為明確最佳的測定部位，首先測定了距根尖0-2000μm范圍的主根中k⁺離子流的變化情況；如圖4所示，棉花幼苗的k⁺離子流呈內流狀態(tài)，且呈現(xiàn)單峰曲線，其中在600-800μm處k⁺離子流速達最高；不同材料間比較，z571在0-2000μm范圍中k⁺離子流速較高，其中在300-1000μm范圍中k⁺離子流速要顯著高于xm99b的流速。同時，還測定了根毛區(qū)(大約距根尖25000μm處)和根毛中k⁺離子的變化；如圖4所示，k⁺離子流呈略微外排的狀態(tài)，但不同的材料間無顯著的差異。

3.結論

本研究通過電生理和技術，建立了一種快速、高效的室內鑒定棉花幼苗鉀吸收能力的方法。不同的生長環(huán)境中(低鉀脅迫水培和蛭石)培養(yǎng)的幼苗不同部位根系的k⁺離子流狀態(tài)有所差別。

在水培條件下，低鉀脅迫6天的幼苗根系中k⁺離子呈外排狀態(tài)，且距根尖在0-600μm范圍中k⁺離子外排較低；不同材料間比較，材料間主根中k⁺離子速率無顯著差異，而中上部側根中k⁺離子速率差異顯著，即耐低鉀的材料保留k⁺離子強于鉀敏感品種。

采用蛭石培養(yǎng)6天的幼苗，主根中k⁺離子呈內流狀態(tài)，呈現(xiàn)單峰曲線，在600-800μm處k⁺離子流速達最高；不同材料間比較，z571在300-1000μm范圍中k⁺離子流速要顯著高于xm99b的流速；根毛區(qū)和根毛中k⁺離子流呈略微外排的狀態(tài)，但不同的材料間無顯著的差異。

本研究證實，利用電生理技術測定低鉀脅迫(0.1mmoll^-1)6天的棉花幼苗的上部側根中k⁺離子流，同時結合在蛭石培養(yǎng)6天的棉花幼苗主根中k⁺離子流的情況，可以快速有效的區(qū)分和篩選出耐低鉀性較強的棉花種質材料。

實施例1

本實施例提供一種棉花樣品的耐低鉀性的鑒定方法，包括如下步驟：

(1)以中571(z571)和新棉99b(xm99b)分別為耐低鉀和鉀敏感對照，對中棉所41(ccri41)、中棉所45(ccri45)、新陸中61(xlz61)和中51504(z51504)的棉花樣品進行鑒定，參試棉花種子均由中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所提供。

采用非損傷性微測技術(nmt)測定低鉀脅迫6天(水培培養(yǎng))和發(fā)苗6天(蛭石培養(yǎng))棉花幼苗的鉀離子流速，培養(yǎng)條件同上文。

選生長整齊的棉花幼苗，用刀片分別切取水培條件下幼苗中上部根系(～3cm)及蛭石培養(yǎng)條件下主根根系(～3cm)作為待測組織樣品。

(2)將待測組織樣品先用去離子水沖洗干凈，再將其浸沒在蒸餾水15min，接著浸入20ml測試液中平衡15min；

(3)將步驟(2)處理好的待測組織樣品轉入新的20ml測試液中，開始測試待測樣品的凈k離子流；

測試液配方：0.1mmoll^-1kcl、0.1mmoll^-1cacl2、0.3mmoll^-1mes，ph6.0；

測定部位：水培條件下幼苗根系的測定部位距根尖300μm處，蛭石培養(yǎng)條件下幼苗的測試部位距根尖600μm；

每處理測定8株幼苗，測試持續(xù)7～10min(達到穩(wěn)定狀態(tài))，計算時舍棄前2～3min的數(shù)據(jù)。

(4)結果

a、低鉀脅迫6天(水培培養(yǎng))幼苗根系的k⁺離子呈現(xiàn)外排(圖5)；其中，耐低鉀材料z571的k⁺離子外排速率顯著低于鉀敏感品種xm99b；

其它材料間相比，ccri45的k⁺離子外排速率顯著高于鉀敏感品種xm99b，而ccri41的k⁺離子外排速率與鉀敏感品種xm99b無顯著差異；z51504和xlz61的k⁺離子外排速率顯著低于鉀敏感品種xm99b，但與耐低鉀材料z571的k⁺離子外排速率無顯著差異。

b、發(fā)苗6天(蛭石培養(yǎng))ccri45的幼苗根系的k⁺離子呈現(xiàn)略微的外排狀態(tài)，而其他材料幼苗根系的k⁺離子則呈現(xiàn)吸收狀態(tài)(圖6)；

其中，鉀敏感品種xm99b和ccri41的k⁺離子吸收速率較低，且兩材料間無顯著差異；而耐低鉀材料z571、z51504和xlz61的k⁺離子吸收速率較高，尤其是xlz61的k⁺離子吸收速率最高，要顯著高于其他材料。

這些結果表明，不同的材料間保留或吸收k⁺離子的能力有明顯的差異，可以通過測定k⁺離子流的結果，快速的判定不同棉花材料間耐低鉀能力的差異。以z51504為例，水培培養(yǎng)后，其k⁺離子外排速率顯著低于鉀敏感品種xm99b，略高于耐低鉀材料z571的k⁺離子外排速率，但無顯著差異；蛭石培養(yǎng)后，z51504的k⁺離子吸收速率顯著高于鉀敏感品種xm99b，略高于耐低鉀材料z571的k⁺離子吸收速率，但無顯著差異；說明了z51504的保留或吸收k⁺離子的能力強于鉀敏感品種xm99b，而與z571的保留或吸收k⁺離子的能力相差不大，屬于耐低鉀材料。

由上述結果可知，測試樣品中：

(1)ccri45保留或吸收k⁺離子的能力顯著低于鉀敏感品種xm99b，屬于鉀極敏感品種；

(2)ccri41保留或吸收k⁺離子的能力與鉀敏感品種xm99b無顯著差異，屬于鉀敏感品種；

(3)z51504保留或吸收k⁺離子的能力與耐低鉀材料z571無顯著差異，屬于耐低鉀材料；

(4)xlz61保留或吸收k⁺離子的能力顯著高于耐低鉀材料z571，屬于強耐低鉀材料。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。