本發(fā)明涉及生物學和醫(yī)學技術領域，尤其是涉及一種流式分選活性細胞特別是單細胞的精準涂片方法。

背景技術：

生物樣本包含細胞，細胞之間均有差異性，將活性細胞逐一分離出來進行研究，有助于了解生物樣本的多樣性。

對含量稀少的細胞(低至百萬分之一，甚至更低)，比如腫瘤患者外周血中的循環(huán)腫瘤細胞、腫瘤患者體內(nèi)積液中的腫瘤細胞、孕婦外周血中的胎兒有核紅細胞，可取得的目的細胞極少，并且這些生物樣本的時效性強，樣本具有不可復制性，快速精準的活性細胞分離和分析對疾病的及時診斷或產(chǎn)前診斷尤為重要，活性細胞圖像分析是重要的技術手段之一。

流式細胞儀用于檢測液流中的細胞特性，即流式細胞儀的顯著特征為快速分析細胞的多個特性，并根據(jù)細胞的特性高效精準分選目的細胞。也就是說，流式細胞儀能將復雜樣本中單個活性細胞快速精準地直接分選至載玻片上，但含細胞的液滴迅速干燥，形成鹽結(jié)晶，導致細胞膜破裂，無法看到完整的細胞。又或者在載玻片上滴等滲液體，將活性細胞分選到等滲液體中，然后蓋上蓋玻片使細胞在等滲液體中保存較長時間，但蓋玻片覆蓋的過程，會造成細胞流失，并且這種情況下，無法對細胞進行染色處理，等滲液體干燥后，同樣形成鹽結(jié)晶，導致細胞破裂。這兩種情況均破壞或影響了細胞的形態(tài)，無法進行完整的圖像分析。

也就是說，現(xiàn)有的各種技術均無法精準地把活性細胞特別是單細胞放到載玻片上，且容易丟失，不便于形態(tài)觀察。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明主要解決的技術問題是提供一種流式分選活性細胞的精準涂片方法，解決了現(xiàn)有技術中無法精準地把活性細胞特別是單細胞放到載玻片上的技術問題。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用的一個技術方案是：提供一種流式分選活性細胞的精準涂片方法，包括：將收集管設置在流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流的下方；在收集管的底部添加第一緩沖液；調(diào)整流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流所噴射方向的位置和/或收集管的位置，使分選液流恰好射入收集管的底部的第一緩沖液中；在流式細胞儀上選擇待分選的活性細胞，并輸出包含有活性細胞的分選液流，使包含有活性細胞的分選液流輸出至收集管的底部；將收集管設置在離心涂片機上，并通過離心涂片機將活性細胞精準涂到載玻片上。

其中，輸出包含有活性細胞的分選液流的步驟之后，且在將收集管設置在離心涂片機上的步驟之前，該方法還包括：在收集管底部的第一緩沖液上再添加第二緩沖液，以通過第二緩沖液覆蓋在包含有分選液流的第一緩沖液上。

其中，在收集管的底部添加第一緩沖液的步驟包括：在收集管的底部添加包括有蛋白質(zhì)的第一緩沖液。

其中，在收集管底部的第一緩沖液上再添加第二緩沖液的步驟包括：在收集管底部的第一緩沖液上再添加包括有蛋白質(zhì)的第二緩沖液。

其中，收集管包括第一管體和第一管體連通的第二管體，其中第一管體和第二管體的連接呈l型狀設置，且第一管體設置在流式細胞儀用于輸出包含有活性細胞的分選液流的輸出口的下方。

其中，將收集管設置在離心涂片機上，并通過離心涂片機將活性細胞精準涂到載玻片上的步驟包括：將收集管的第二管體與載玻片連接；將設有載玻片的收集管固定在離心涂片機上；啟動離心涂片機，使得收集管跟隨離心涂片機轉(zhuǎn)動，從而將收集管中的活性細胞精準涂到載玻片上。

其中，第二管體與載玻片的連接處設有吸水材料層。

其中，第一緩沖液設置在第一管體和第二管體的連接處中。

其中，收集容器的第一管體和第二管體的連接處的內(nèi)壁呈弧形狀。

本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術的情況，本發(fā)明提供的流式分選活性細胞的精準涂片方法包括：將收集管設置在流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流的下方；在收集管的底部添加第一緩沖液；調(diào)整流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流所噴射方向的位置和/或收集管的位置，使分選液流恰好射入收集管的底部的第一緩沖液中；在流式細胞儀上選擇待分選的活性細胞，并輸出包含有活性細胞的分選液流，使包含有活性細胞的分選液流輸出至收集管的底部；將收集管設置在離心涂片機上，并通過離心涂片機將活性細胞精準涂到載玻片上。通過上述方式，本發(fā)明的涂片方法通過利用流式細胞儀和離心涂片機的結(jié)合，使活性細胞精準落入收集裝置的緩沖液中，再利用離心涂片機將活細胞精準涂到載玻片上，易于進行后續(xù)的形態(tài)學分析。

附圖說明

圖1是本發(fā)明流式分選活性細胞的精準涂片方法的流程示意圖；

圖2是圖1中步驟s105的子步驟流程示意圖；

圖3是本發(fā)明收集管的結(jié)構示意圖；

圖4是本發(fā)明收集管與載玻片連接的結(jié)構示意圖；

圖5是本發(fā)明實施例1的實驗狀態(tài)圖；

圖6是本發(fā)明實施例2的實驗狀態(tài)圖；

圖7是本發(fā)明實施例3的實驗狀態(tài)圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。

如圖1所示，本發(fā)明流式分選活性活性細胞的涂片方法的流程示意圖。該方法包括以下步驟：

步驟s101：將收集管設置在流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流的下方。

在步驟s101中，可以通過固定裝置將收集管固定在流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流的下方。又或者對流式細胞儀進行改造，在流式細胞儀設置有夾具，該夾具能夠?qū)⑹占軍A住，從而實現(xiàn)收集管設置在流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流的下方。

如圖3-4所示，該收集管包括第一管體101和第一管體101連通的第二管體102，其中第一管體101和第二管體102的連接呈l型狀設置，且第一管體101設置在流式細胞儀用于輸出包含有活性細胞的分選液流的輸出口的下方。

應理解，本實施例的第一管體101呈漏斗狀設置，第一管體101的內(nèi)徑較小的一端與第二管體102連通，這樣第一管體101設置在流式細胞儀用于輸出包含有活性細胞的分選液流的輸出口的下方的內(nèi)徑比較大，更容易落入包含有活性細胞的分選液流。當然，本發(fā)明并不限定第一管體101呈漏斗狀設置，在一些實施例中，第一管體101還可以呈其他形狀，如矩形狀或圓柱狀，只要能夠?qū)崿F(xiàn)包含有活性細胞的分選液流落入第一管體101即可。

步驟s102：在收集管的底部添加第一緩沖液。

其中，第一緩沖液設置在第一管體101和第二管體102的連接處中。

在本實施例中，收集容器的第一管體101和第二管體102的連接處的內(nèi)壁呈弧形狀，這樣第一管體101和第二管體102的連接處不會儲存有太多的第一緩沖液，方便全部輸出第一緩沖液，以全部輸出活性細胞，不會殘留活性細胞在收集管內(nèi)。

在本實施例中，優(yōu)選在收集管的底部添加包括有蛋白質(zhì)的第一緩沖液。其中第一緩沖液的容量范圍為50-200微升。

步驟s103：調(diào)整流式細胞儀輸出包含有活性細胞的分選液流所噴射方向的位置和/或收集管的位置，使分選液流恰好射入收集管的底部的第一緩沖液中。

在步驟s103中，可以通過多種方式調(diào)整，即可以調(diào)整流式細胞儀，也可以調(diào)整收集管，使得分選液流恰好射入收集管的底部的第一緩沖液中。

步驟s104：在流式細胞儀上選擇待分選的活性細胞，并輸出包含有活性細胞的分選液流，使包含有活性細胞的分選液流輸出至收集管的底部。

步驟s105：將收集管設置在離心涂片機上，并通過離心涂片機將活性細胞精準涂到載玻片上。

應理解，在上述輸出包含有單細胞的分選液流的步驟之后，且在將收集管設置在離心涂片機上的步驟之前，該方法還包括：在收集管底部的第一緩沖液上再添加第二緩沖液，以通過第二緩沖液覆蓋在包含有分選液流的第一緩沖液上。本實施例通過第一緩沖液和第二緩沖液將包含有活性細胞的分選液流包住，能夠降低活性細胞的損失。

在本實施例中，優(yōu)選在收集管底部的第一緩沖液上再添加包括有蛋白質(zhì)的第二緩沖液，其中第二緩沖液的容量范圍為50-200微升。

如圖2所示，步驟105包括以下子步驟：

步驟s1051：將收集管的第二管體102與載玻片104連接。

在本實施例中，第二管體102與載玻片104連接的一端設有一呈圓環(huán)狀的黏膠層103，可通過該黏膠層103黏住載玻片104，從而實現(xiàn)第二管體102與載玻片104的連接。

步驟s1052：將設有載玻片102的收集管固定在離心涂片機上。

步驟s1051：啟動離心涂片機，使得收集管跟隨離心涂片機轉(zhuǎn)動，從而將收集管中的活性細胞涂到載玻片104上。

在本實施例中，第二管體102與載玻片104的連接處設有吸水材料層105，能夠?qū)ν坎荚谳d玻片104上水進行干燥。其中該吸水材料層105呈圓環(huán)狀，吸水材料層105的內(nèi)徑等于黏膠層103的外徑。

應理解，本實施例先在收集管的底部第一次添加緩沖液，當包含有活性細胞的分選液流輸出至收集管的底部時，再次在收集管底部添加緩沖液，以通過第二次添加的緩沖液覆蓋在包含有分選液流的緩沖液上。本實施例通過將第一緩沖液和第二緩沖液將包含有活性細胞的分選液流包住，能夠降低活性細胞的損失。其中，第一次在收集管的底部添加包括有蛋白質(zhì)的緩沖液的容量范圍為50-200微升，且第二次在收集管的底部添加包括有蛋白質(zhì)的緩沖液的容量范圍為50-200微升。

應理解，離心涂片機主要用于將少量活性細胞涂到載玻片104上并保證細胞形態(tài)的完整。其中活性細胞包括單細胞。應理解，活性單細胞為最極致的方式，本發(fā)明涵蓋了流式分選多細胞涂片方法。

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術中無法實現(xiàn)活性細胞精準涂片的問題，將離心涂片機和流式細胞儀直接結(jié)合起來，使流式細胞儀分選的活性細胞直接落入離心涂片機的收集管中，實現(xiàn)一步法將活性細胞直接涂片。

下面結(jié)合實施例說明本發(fā)明的工作原理。

實施例1

一、樣本制備

取一支5毫升的流式上樣管，標記為a，加入100微升冷緩沖液；

取新鮮的edta(乙二胺四乙酸)抗凝的健康人體檢的外周血，上下顛倒混勻；

吸取外周血5微升到a管中，混勻；

加入cd3fitc/cd4pe/cd45percp(cd：白細胞分化抗原；fitc：異硫氰酸熒光素；pe：藻紅蛋白；percp：多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復合物)混合熒光抗體20微升；

4℃避光孵育15-30分鐘；

加入2ml冷緩沖液，1500rpm離心5分鐘，吸去上清液；

加入500微升冷緩沖液；

在流式細胞儀上檢測前加入pi(碘化丙啶)染料，pi濃度為200微克/毫升。

二、分選液流位置調(diào)整

將收集管固定在流式細胞儀分選液流下方，用來接收分選的單個活性細胞；

在收集管的底部加一滴緩沖液(50-200ul)；

調(diào)整分選液流的位置，使分選液流恰好射入緩沖液中；

調(diào)整好液流后，更換新的收集管，在收集管底部加入一滴緩沖液(50-200ul)。

三、分析及單個活性細胞分選

在流式細胞儀上檢測；

將閾值設為fsc(前向角散射光信號)；

選中所有的cd45+的細胞；

進一步分析cd45+的細胞中pi-的細胞群；

分析pi-細胞群中cd45+cd3+cd4+細胞群，并分選單個活性細胞；

取下收集管，在收集管底部的緩沖液上再加一滴緩沖液(50-200ul)，結(jié)合載玻片，在離心涂片機選擇離心1500轉(zhuǎn)3分鐘，將細胞涂到載玻片上；

載玻片干燥后用瑞氏染液染色觀察，如圖5所示。

實施例2

一、樣本制備

取一支5毫升的流式上樣管，標記為a，加入100微升冷緩沖液；

取新鮮的edta(乙二胺四乙酸)抗凝的健康人體檢的外周血，上下顛倒混勻；

吸取外周血5微升到a管中，混勻；

加入cd3fitc/cd4pe/cd45percp混合熒光抗體20微升；

4℃避光孵育15-30分鐘；

加入2ml冷緩沖液，1500rpm離心5分鐘，吸去上清液；

加入500微升冷緩沖液；

在流式細胞儀上檢測前加入pi(碘化丙啶)染料，pi濃度為200微克/毫升。

二、分選液流位置調(diào)整

將收集管固定在流式細胞儀分選液流下方，用來接收分選的單個活性細胞；

在收集管的底部加一滴緩沖液(50-200ul)；

調(diào)整分選液流的位置，使分選液流恰好射入緩沖液中；

調(diào)整好液流后，更換新的收集管，在收集管底部加入一滴含蛋白緩沖液(50-200ul)。

三、分析及單個活性細胞分選

在流式細胞儀上檢測；

將閾值設為fsc；

選中所有的cd45+的細胞；

進一步分析cd45+的細胞中pi-的細胞群；

分析pi-細胞群中cd45低表達ssc(側(cè)向角散射光信號)高表達粒細胞群，并分選單個活性細胞；

取下收集管，在收集管底部的緩沖液上再加一滴含蛋白緩沖液(50-200ul)，結(jié)合載玻片，在離心涂片機選擇離心1500轉(zhuǎn)3分鐘，將細胞涂到載玻片上；

載玻片干燥后用瑞氏染液染色觀察，如圖6所示。

實施例3

一、樣本制備

取一支5毫升的流式上樣管，標記為a，加入100微升冷緩沖液；

取新鮮的edta(乙二胺四乙酸)抗凝的健康人體檢的外周血，上下顛倒混勻；

吸取外周血5微升到a管中，混勻；

加入cd3fitc/cd4pe/cd45percp混合熒光抗體20微升；

4℃避光孵育15-30分鐘；

加入2ml冷緩沖液，1500rpm離心5分鐘，吸去上清液；

加入500微升冷緩沖液；

在流式細胞儀上檢測前加入pi(碘化丙啶)染料，pi濃度為200微克/毫升。

二、分選液流位置調(diào)整

將收集管固定在流式細胞儀分選液流下方，用來接收分選的單個活性細胞；

在收集管的底部加一滴緩沖液(50-200ul)；

調(diào)整分選液流的位置，使分選液流恰好射入緩沖液中；

調(diào)整好液流后，更換新的收集管，在收集管底部加入一滴緩沖液(50-200ul)。

三、分析及單個活性細胞分選

在流式細胞儀上檢測；

將閾值設為fsc；

選中所有的cd45+的細胞；

進一步分析cd45+的細胞中pi-的細胞群；

在流式細胞儀上選擇cd45中表達ssc(側(cè)向角散射光信號)中表達單核細胞群，分選單個活性細胞；；

取下收集管，結(jié)合載玻片，在離心涂片機選擇離心1500轉(zhuǎn)3分鐘，將細胞涂到載玻片上；

載玻片干燥后用瑞氏染液染色觀察，如圖7所示。

綜上，本發(fā)明的涂片方法通過控制收集管和收集管中緩沖液的位置，以及收集管中緩沖液的體積和成分，使流式分選的活性細胞特別是單細胞精準落入收集管的緩沖液中，利用離心涂片機的功能實現(xiàn)活性細胞的涂片，能夠把活性細胞特別是單細胞精準涂到載玻片上且不丟失，易于染色觀察。

以上所述僅為本發(fā)明的實施方式，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。