本發(fā)明屬于心血管病體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于人體血液樣品中rcn2標志物的濃度水平的心血管病檢測方法以及rcn2標志物在心血管病檢測中的應用。

背景技術(shù)：

心血管病是心臟血管疾病的統(tǒng)稱，泛指由于高脂血癥、血液黏稠、動脈粥樣硬化、高血壓等所導致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病。心血管病是一種嚴重威脅人類，特別是50歲以上中老年人健康的常見病，具有高患病率、高致殘率和高死亡率的特點，即使應用目前最先進、完善的治療手段，仍可有50%以上的腦血管意外幸存者生活不能完全自理，全世界每年死于心血管病的人數(shù)高達1500萬人，居各種死因首位。

動脈粥樣硬化是冠心病、缺血性中風和外周動脈疾病發(fā)生的主要原因。雖然動脈粥樣硬化的死亡率在過去三十年來由于有效的預防和他汀類降脂藥物的治療急劇下降，但這種疾病仍然比任何其他疾病剝奪更多人生命。氧化低密度脂蛋白附著在內(nèi)皮下層引起的動脈炎癥反應是動脈粥樣硬化斑塊發(fā)生、發(fā)展甚至破裂的的關(guān)鍵過程。目前最有價值的動脈粥樣硬化標志物是c-reactiveprotein(crp)，crp主要在肝臟中產(chǎn)生，并不是動脈粥樣硬化特定的。高水平的crp表明發(fā)生了炎癥誘導的急性期反應，比如感染、外傷、過敏等。而且crp的基礎(chǔ)水平由基因決定，個人因為基因升高的crp常常顯示沒有進一步增加患心血管疾病的風險。因此，建立一個能準確地預測氧化低密度脂蛋白誘導的血管壁炎癥的標記物將是對抗心血管疾病的一個重要進程。

rcn2（網(wǎng)鈣蛋白2）是屬于鈣腔蛋白中的一種，是一種位于哺乳動物體內(nèi)的低親和力鈣結(jié)合蛋白，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)和高爾基體中均有表達。

血小板活化是動脈粥樣硬化發(fā)生和血栓形成的重要發(fā)病機制之一。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)凝血酶等激活后，血小板可釋放其胞質(zhì)中的rcn2作為分泌性蛋白，rcn2能通過自分泌和旁分泌方式參與粥樣硬化斑塊和血栓形成的病理機制。免疫組化分析顯示，在人類有動脈粥樣硬化斑塊的血管壁上可檢測到rcn2存在，而正常血管段則未發(fā)現(xiàn)rcn2的表達，進一步的研究發(fā)現(xiàn)rcn2是血管內(nèi)血栓形成的重要條件因素，同時rcn2可影響纖維細胞的表現(xiàn)，促其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，參與動脈粥樣硬化病灶的形成。

存在上述情況，本發(fā)明提供一種基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測方法及使用該方法的試劑盒，其利用親和素-生物素結(jié)合elisa的方法檢測rcn2濃度水平從而檢測心血管病，通過使用酶標儀測定吸光度得出rcn2的濃度，當rcn2濃度水平為小于20ng/ml，樣品所屬人體為健康個體，當rcn2濃度水平為大于20ng/ml，樣品所屬人體為高患病風險個體。本發(fā)明提供的檢測方法具有特異性強、檢測準確率高的優(yōu)點。

一種基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測方法，其通過檢測rcn2濃度水平從而檢測心血管病。

優(yōu)選地，基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測方法利用親和素-生物素結(jié)合elisa的方法檢測rcn2濃度水平從而檢測心血管病。

優(yōu)選地，基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測方法包括如下步驟：

步驟s111包被抗體：包被緩沖液將rcn2特異性抗體稀釋固著于elisa微孔板上；

步驟s112加入樣本：將待測樣品與標準蛋白稀釋后加至elisa酶標板孔中，25~40℃孵育1-2小時；

步驟s113加入檢測抗體：分別加入生物素標記的rcn2特異抗體，25~40℃孵育1-2小時后，洗滌液洗滌1~5次，每次1~5min；

步驟s114引入酶標：分別加入親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物，25~40℃孵育1-2小時后，洗滌液洗滌1~5次，每次1~5min；

步驟s115底物反應：分別加入顯色底物顯色15~30min，加入終止液中止反應；

步驟s116檢測：使用酶標儀在450nm處測定樣品吸光度，計算出rcn2濃度；

步驟s117結(jié)果判斷：當rcn2濃度水平為小于20ng/ml，樣品所屬人體為健康個體，當rcn2濃度水平為大于20ng/ml，樣品所屬人體為高患病風險個體。

一種基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒，該試劑盒是elisa檢測試劑盒，包括：包被有rcn2抗體的elisa酶標板、檢測rcn2抗原的抗體、酶結(jié)合物、標準蛋白、樣品稀釋液、包被緩沖液、封閉液、酶標板洗滌液、顯色液和終止液。

優(yōu)選地，所述的elisa檢測試劑盒中：

所述的酶標板包被抗體為鼠抗人rcn2單克隆抗體；

所述的檢測抗體是生物素標記的兔抗人rcn2抗體；

所述的酶結(jié)合物是親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物；

所述的標準蛋白是重組人rcn2蛋白；

所述的包被緩沖液是1×pbs，ph：7.4；

所述的封閉液是5%牛血清白蛋白+pbs溶液的封閉液；

所述的酶標板洗滌液是含0.25%tween-20的1×pbs溶液；

所述的樣品稀釋液是1×pbs；

所述的顯色液是3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺；

所述的終止液是2mol/l的硫酸溶液。

進一步，所述的檢測試劑盒所使用的檢測方法包括以下步驟：

步驟s111包被抗體：包被緩沖液將rcn2特異性抗體稀釋，在elisa酶標板的每孔中加入100ul，封板后置于4℃孵育過夜，備用；

步驟s112加入樣本：將待檢樣本用樣品稀釋液以一定比例稀釋，以100ul/孔的體積加樣；標準蛋白用樣品稀釋液稀釋成不同濃度梯度，以100ul/孔的體積加樣，37℃孵育2小時；

步驟s113加入檢測抗體：棄去孔內(nèi)樣本，加入生物素標記的rcn2特異抗體，每孔100ul，37℃孵育1小時后，棄去孔內(nèi)抗體，加入洗滌液洗滌3次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步驟s114引入酶標：加入親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物，37℃孵育1小時后，棄去孔內(nèi)抗體，加入洗滌液洗滌5次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步驟s115底物反應：加入tmb顯色底物，每孔90ul，顯色20min后，每孔加入50ul終止液中止反應；

步驟s116檢測：使用酶標儀在450nm處測定樣品吸光度，校正波長為540nm或者570nm，計算出rcn2濃度。

進一步，上述基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒在心血管診斷中應用。

其中，所述的心血管病包括冠心?。╟hd）、周圍動脈疾病（pad）。

其中，在判斷患病風險時，健康人rcn2濃度水平為小于20ng/ml，當大于20ng/ml時，則代表具有較高患病風險。

附圖說明

圖1，基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒檢測正常人群和冠心病患者的rcn2濃度結(jié)果對比圖。

圖2，基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒檢測正常人群和周圍動脈疾病患者的rcn2濃度結(jié)果對比圖。

圖3，92個chd患者血液樣本中rcn2濃度和高密度脂蛋白濃度的統(tǒng)計學相關(guān)關(guān)系圖。

圖4，92個chd患者血液樣本中rcn2濃度和舒張壓的統(tǒng)計學相關(guān)關(guān)系圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的描述。

實施例一：一種基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒。

該試劑盒是elisa檢測試劑盒，包括：包被有rcn2抗體的elisa酶標板、檢測rcn2抗原的抗體、酶結(jié)合物、標準蛋白、樣品稀釋液、包被緩沖液、封閉液、酶標板洗滌液、顯色液和終止液，其中：

所述的酶標板包被抗體為鼠抗人rcn2單克隆抗體；

所述的檢測抗體是生物素標記的兔抗人rcn2抗體；

所述的酶結(jié)合物是親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物；

所述的標準蛋白是重組人rcn2蛋白；

所述的包被緩沖液是1×pbs，ph：7.4；

所述的封閉液是5%牛血清白蛋白+pbs溶液的封閉液；

所述的酶標板洗滌液是含0.25%tween-20的1×pbs溶液；

所述的樣品稀釋液是1×pbs；

所述的顯色液是3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺；

所述的終止液是2mol/l的硫酸溶液。

與該試劑盒所匹配使用的檢測方法包括以下步驟：

步驟s111包被抗體：包被緩沖液將rcn2特異性抗體稀釋，在elisa酶標板的每孔中加入100ul，封板后置于4℃孵育過夜，備用；

步驟s112加入樣本：將待檢樣本用樣品稀釋液以一定比例稀釋，以100ul/孔的體積加樣；標準蛋白用樣品稀釋液稀釋成不同濃度梯度，以100ul/孔的體積加樣，37℃孵育2小時；

步驟s113加入檢測抗體：棄去孔內(nèi)樣本，加入生物素標記的rcn2特異抗體，每孔100ul，37℃孵育1小時后，棄去孔內(nèi)抗體，加入洗滌液洗滌3次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步驟s114引入酶標：加入親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物，37℃孵育1小時后，棄去孔內(nèi)抗體，加入洗滌液洗滌5次，每孔300ul，每次2min，甩干；

步驟s115底物反應：加入tmb顯色底物，每孔90ul，顯色20min后，每孔加入50ul終止液中止反應；

步驟s116檢測：使用酶標儀在450nm處測定樣品吸光度，校正波長為540nm或者570nm，計算出rcn2濃度。

實施例二：一種基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測方法。

按以下步驟使用基于rcn2標志物檢測的心血管病檢測試劑盒對健康正常人、冠心病患者和周圍動脈疾病患者的血液樣品進行rcn2濃度水平檢測：

步驟s111包被抗體：包被緩沖液將rcn2特異性抗體稀釋固著于elisa微孔板上；

步驟s112加入樣本：將待檢樣本與標準蛋白稀釋后加至elisa酶標板孔中，35℃孵育1.52小時；

步驟s113加入檢測抗體：分別加入生物素標記的rcn2特異抗體，35℃孵育1.5小時后，洗滌液洗滌3次，每次3min；

步驟s114引入酶標：分別加入親和素交聯(lián)辣根過氧化物酶結(jié)合物，35℃孵育1.5小時后，洗滌液洗滌3次，每次3min；

步驟s115底物反應：分別加入顯色底物顯色20min，加入終止液中止反應；

步驟s116檢測：使用酶標儀在450nm處測定樣品吸光度，計算出rcn2濃度；

步驟s117結(jié)果判斷：當rcn2濃度水平為小于20ng/ml，樣品所屬人體為健康個體，當rcn2濃度水平為大于20ng/ml，樣品所屬人體為高患病風險個體。

結(jié)果如附圖1和附圖2所示，健康正常人的rcn2濃度為18ng/ml，冠心病患者的rcn2濃度為55ng/ml，周圍動脈疾病患者的的rcn2濃度為92ng/ml。

實施例三：rcn2濃度與患者體內(nèi)相關(guān)變量的相關(guān)關(guān)系檢測。

按以下步驟測量rcn2濃度與人體高密度脂蛋白濃度水平、血管舒張壓的相關(guān)關(guān)系：

步驟s111測量rcn2濃度：抽取92個心血管病患者的血液樣品作為實驗樣本，使用實施例一提供的試劑盒和試劑盒使用的檢測方法檢測92個樣本的rcn2濃度；

步驟s112測量高密度脂蛋白濃度：使用常規(guī)高密度脂蛋白濃度檢測方法檢測患者的高密度脂蛋白濃度，并使用統(tǒng)計學方法對rcn2濃度和高密度脂蛋白濃度進行統(tǒng)計分析；

步驟s113測量舒張壓：使用常規(guī)血壓檢測方法檢測患者血壓舒張壓，并使用統(tǒng)計學方法對rcn2濃度和舒張壓進行統(tǒng)計分析。

統(tǒng)計分析結(jié)果如附圖3所示，rcn2濃度和高密度脂蛋白濃度呈顯著負相關(guān)，表明rcn2濃度越大，高密度脂蛋白濃度越小。高密度脂蛋白運載周圍組織中的膽固醇，再轉(zhuǎn)化為膽汁酸或直接通過膽汁從腸道排出，動脈造影證明高密度脂蛋白膽固醇含量與動脈管腔狹窄程度呈顯著的負相關(guān)。所以高密度脂蛋白是一種抗動脈粥樣硬化的血漿脂蛋白，是冠心病的保護因子，俗稱“血管清道夫”。證明rcn2的濃度與心血管病患病風險存在一定關(guān)系，rcn2能夠作為檢測標志物，在心血管病檢測中進行應用。

另外從附圖4中也可以看出，rcn2濃度和舒張壓呈顯著正相關(guān)，表明rcn2濃度越大，舒張壓的壓力越大，心血管病患病風險越大。證明rcn2的濃度與心血管病患病風險存在一定關(guān)系，rcn2能夠作為檢測標志物，在心血管病檢測中進行應用。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。